聶芙蓉,張晨曦, 江青東,劉太宇,鄧紅雨

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046；2. 河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

女貞子為木犀科植物女貞的成熟果實(shí)，其性味甘、苦、涼，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的作用，其含有豐富的粗蛋白、氨基酸和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1,4]。女貞子現(xiàn)在主要作為城市綠化樹(shù)種，其產(chǎn)量高，且多數(shù)地區(qū)的女貞子都未被采收利用，導(dǎo)致大部分資源浪費(fèi)，若加以利用，可產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

中草藥在動(dòng)物生產(chǎn)方面的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)已成為當(dāng)今人們研究的一大熱點(diǎn)，中草藥在人們追求“安全、綠色、無(wú)殘留”的觀念中具有不可低估的份量[2]。但中草藥藥效慢，有的效果不太理想，劑量往往偏大，一般都在1%-2%，這主要與中草藥有效成分含量不高，植物細(xì)胞壁阻礙有效成分的滲出、吸收有很大關(guān)系[3]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用微生物發(fā)酵中草藥來(lái)提高藥效，取代抗生素，在畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面變得越來(lái)越重要，已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

利用不同微生物對(duì)女貞子發(fā)酵的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)利用酵母菌、枯草芽孢桿菌對(duì)女貞子進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定女貞子被發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性成分含量的變化，為女貞子在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用，開(kāi)發(fā)新的飼料添加劑提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

菌種：酵母菌、枯草芽孢桿菌，均由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

女貞子：購(gòu)于鄭州隆泰大藥房。

2 試驗(yàn)方法

2.1 女貞子發(fā)酵前的預(yù)處理

將女貞子置于65℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎后過(guò)60目篩，121℃高壓蒸汽滅菌30min，備用。

2.2 培養(yǎng)基的配制

2.2.1 LB培養(yǎng)基的制備

本試驗(yàn)采用LB固體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基。500mL的LB液體培養(yǎng)基，需向500mL去離子水中加入1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母粉、1%的氯化鈉，加熱攪拌直至溶質(zhì)全部溶解后調(diào)pH至7.0，121℃高壓蒸汽滅菌15 min，備用。配制500mL的LB固體培養(yǎng)基，在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%-2%的瓊脂粉即可，加熱攪拌直至溶質(zhì)全部溶解，調(diào)pH至7.0，121℃高壓蒸汽滅菌15min，倒平板，置入超凈臺(tái)上備用。

2.2.2 PDA固體培養(yǎng)基的制備

配制500mL的PDA固體培養(yǎng)基，在500mL去離子水中加入18.5gPDA粉末，加熱攪拌直至溶質(zhì)全部溶解后調(diào)pH至7.0，然后121℃高壓蒸汽滅菌15min，倒平板，置入超凈工作臺(tái)上備用。

2.2.3 YPD液體培養(yǎng)基的配制

配制500mL的YPD液體培養(yǎng)基，需向500mL去離子水中加入1%的蛋白胨、0.5%的酵母粉、2%的氯化鈉,攪拌直至溶質(zhì)全部溶解后，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，然后121℃高壓蒸汽滅菌15min，備用。

2.3 菌種的純化及菌懸液制備

2.3.1 酵母菌的純化及菌懸液制備

酵母菌純化：在超凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于PDA固體培養(yǎng)基上平板劃線后，放入30℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出，鏡檢。

酵母菌菌懸液制備：在超凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于YPD液體培養(yǎng)基，搖勻，于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，鏡檢，計(jì)活菌數(shù)，為108個(gè)/mL，放入4℃冰箱，備用。

2.3.2 枯草芽孢桿菌的純化及菌懸液制備

枯草芽孢桿菌的純化：在超凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于LB固體培養(yǎng)基上平板劃線后，放入30℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出，鏡檢。

枯草芽孢桿菌菌懸液制備：在超凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基，搖勻，于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，鏡檢，計(jì)活菌數(shù)，為108個(gè)/mL，放入4℃冰箱，備用。

2.4 接種發(fā)酵

試驗(yàn)分為四組，分別記為對(duì)照組、試驗(yàn)組1、2、3，每組三個(gè)重復(fù)

對(duì)照組: 分別準(zhǔn)確稱取粉碎滅菌后的女貞子粉50g于5個(gè)500mL的三角瓶中，添加無(wú)菌水混合均勻。

試驗(yàn)1組：分別稱取粉碎滅菌后的女貞子粉末50g于5個(gè)500mL的三角瓶中，酵母菌接菌量為10%(約15mL)，添加無(wú)菌水混合均勻。

試驗(yàn)2組：分別稱取粉碎滅菌后的女貞子粉末50g于5個(gè)500mL的三角瓶中，枯草芽孢桿菌接菌量為10%(約15mL)，添加無(wú)菌水混合均勻。

試驗(yàn)3組：分別稱取粉碎滅菌后的女貞子粉末50g于5個(gè)500mL的三角瓶中，酵母菌接菌量為5%(約7.5mL)，枯草芽孢桿菌接菌量為5%(約7.5mL)，添加無(wú)菌水混合均勻。

上述操作均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，避免被污染，并盡快完成。將接種后的女貞子置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵8d。

2.5 女貞子營(yíng)養(yǎng)成分及活性物質(zhì)含量的測(cè)定

營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定：粗蛋白的測(cè)定用凱氏定氮法，粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的測(cè)定用濾袋法。

活性物質(zhì)含量測(cè)定：齊墩果酸、熊果酸、女貞苷、特女貞苷采用高效液相色譜法測(cè)定；多糖類和黃酮類采用紫外分光光度法測(cè)定，以上均在河南中醫(yī)藥大學(xué)龍子湖校區(qū)BM612中藥理化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件作圖，并用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同菌種發(fā)酵處理對(duì)女貞子營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

表1 不同菌種發(fā)酵對(duì)女貞子營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響(n=5) mg/g

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，肩標(biāo)相同或不標(biāo)注者表示差異不顯著(P>0.05)，下表同

由表1可以看出， 試驗(yàn)1、2、3三組的CP均高于對(duì)照組， 且試驗(yàn)3組CP含量均顯著(P<0.01)高于對(duì)照組及試驗(yàn)1、2組，比對(duì)照組升高了19.86%；試驗(yàn)1、2組與對(duì)照組相比CP略有升高，但差異不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)1、2組之間CP含量基本接近。

試驗(yàn)1、2、3三組中CF、NDF、ADF較對(duì)照組均有所降低。試驗(yàn)1、2組間CF差異不顯著(P>0.05)，但與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)； 試驗(yàn)1、2組間NDF差異顯著(P<0.05)，且與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)1、2組間的ADF差異不顯著(P>0.05)，但與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；試驗(yàn)3組的CF、NDF、ADF下降最為明顯，較對(duì)照組分別下降20.38%、13.58%、14.67%，且與對(duì)照組、試驗(yàn)1、2三組差異極顯著(P<0.01)。

3.2 不同菌種發(fā)酵處理對(duì)女貞子生物活性物質(zhì)含量的影響

3.2.1 不同菌種發(fā)酵處理對(duì)女貞子中裂環(huán)環(huán)烯醚萜類和三萜類含量的影響

表2 不同菌種發(fā)酵對(duì)女貞子中裂環(huán)環(huán)烯醚萜類、三萜類含量的影響(n=5) mg/g

由表2可以看出，試驗(yàn)1組女貞苷含量顯著(P<0.01)高于對(duì)照組、試驗(yàn)2、3組，且比對(duì)照組升高21.71%，試驗(yàn)1、2組及對(duì)照組三組間女貞苷含量無(wú)顯著差異(P>0.05)；試驗(yàn)1、2、3組女貞苷含量均顯著(P<0.01)高于對(duì)照組，但試驗(yàn)1組與2、3組間均差異顯著(P<0.05)，試驗(yàn)2、3組間差異不顯著(P>0.05)。

齊墩果酸含量在三個(gè)試驗(yàn)組中均比對(duì)照組顯著(P<0.01)升高，分別比對(duì)照組升高50.97%、80.16%、76.67%，但試驗(yàn)1組與2、3組差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)2、3組之間差異不顯著(P>0.05)；熊果酸含量在試驗(yàn)1、2、3組分別比對(duì)照組升高35.46%、51.24%、51.42%，且差異極顯著(P<0.01), 但三個(gè)試驗(yàn)組間含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3.2.2 不同菌種發(fā)酵處理對(duì)女貞子中總多糖和總黃酮含量的影響

表3 不同菌種發(fā)酵對(duì)女貞子中總多糖、總黃酮含量的影響(n=5) mg/g

由表3可以看出，總多糖含量在試驗(yàn)1、3組分別比對(duì)照組顯著(P<0.01)升高31.88%、40.72%，試驗(yàn)2組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，三個(gè)試驗(yàn)組間也存在極顯著差異(P<0.01)；總黃酮含量在試驗(yàn)1、2、3組均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，且試驗(yàn)3組最為明顯，比對(duì)照組升高43.82%，試驗(yàn)1、2組間差異顯著(P>0.05)，但試驗(yàn)3組與試驗(yàn)1、2組均差異極顯著(P<0.01)。

4 討論

4.1 微生物發(fā)酵女貞子對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

中藥微生物轉(zhuǎn)化或生物催化, 是利用微生物的生長(zhǎng)代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的酶, 經(jīng)體外生物轉(zhuǎn)化技術(shù), 對(duì)藥物結(jié)構(gòu)加以修飾和轉(zhuǎn)化, 顯著提高中藥有效成分的含量[5，6-8]。微生物在生長(zhǎng)代謝中產(chǎn)生多種酶破壞了女貞子中的纖維素及半纖維素的結(jié)構(gòu)，使其降解形成各種糖類物質(zhì)，并轉(zhuǎn)化為VFA、CO2等。VFA為微生物菌體蛋白的合成提供碳架，使蛋白含量增加。女貞子中的纖維存在于細(xì)胞壁中，微生物發(fā)酵女貞子，可使部分女貞子細(xì)胞壁成分降解成可溶性糖，降低女貞子中纖維的含量，從而提高女貞子中營(yíng)養(yǎng)成分的利用率。

付敏等[9]采用枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白地霉3個(gè)菌種對(duì)菜籽餅進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵, 優(yōu)化發(fā)酵條件, 并結(jié)合中試發(fā)酵檢測(cè)發(fā)酵后菜籽餅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化, 結(jié)果顯示, 發(fā)酵后菜籽餅游離氨基酸含量提高了300.00%, 小肽含量提高了385.19%。周慶民等[10]人利用淀粉芽孢桿菌發(fā)酵黃芪莖葉，結(jié)果表明，黃芪莖葉通過(guò)生物發(fā)酵后，纖維含量降低，粗蛋白含量有所增加，本試驗(yàn)結(jié)果與其結(jié)果相似，表明微生物發(fā)酵女貞子會(huì)使其粗蛋白含量增加，纖維降解，女貞子利用率提高。

4.2 微生物發(fā)酵女貞子對(duì)其生物活性物質(zhì)含量的影響

女貞子中的生物活性物質(zhì)多存在于細(xì)胞胞漿中，經(jīng)不同微生物發(fā)酵處理后，微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的多種胞外酶進(jìn)入培養(yǎng)基，引起女貞子細(xì)胞破裂，使有效成分暴露出來(lái)[11]。

經(jīng)微生物發(fā)酵過(guò)的女貞子，其女貞苷含量都有所提高，但經(jīng)酵母發(fā)酵后的女貞子中女貞苷含量較其他三組差異顯著，表明酵母菌發(fā)酵效果最好；試驗(yàn)2、3兩組中女貞苷與齊墩果酸含量較對(duì)照組、試驗(yàn)1組差異顯著，表明經(jīng)枯草芽孢桿菌和混合菌處理后能最大程度地提高女貞子中女貞苷和齊墩果酸利用率。

經(jīng)微生物處理的試驗(yàn)1、2、3三組多糖類、黃酮類含量均有所升高，且經(jīng)混合菌發(fā)酵后的對(duì)照組多糖、黃酮含量升高40.72%、43.82%，表明混合菌種發(fā)酵效果最好，這與劉洋等[12]人利用混合菌發(fā)酵復(fù)方中草藥所得總黃酮和粗多糖分別比未發(fā)酵提高了55.14%、55.42%結(jié)果相似；楊靜云等[13]人利用紅曲霉菌發(fā)酵山楂、澤瀉、決明子復(fù)方中草藥，結(jié)果表明，發(fā)酵后熊果酸含量提高了767.6%，這與本試驗(yàn)中試驗(yàn)1、2、3三組熊果酸含量分別升高35.46%、51.24%、51.42%的結(jié)果相似。

5 結(jié)論

經(jīng)微生物處理后的女貞子中粗蛋白和生物活性物質(zhì)含量均有所提高，纖維含量降低，大部分以混合菌發(fā)酵效果最好，單菌次之。因此，可以用微生物發(fā)酵女貞子的方式來(lái)提高女貞子的利用率。