索江華，李鳳玲，任慧平，金 婷

( 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州450046 )

河南常見(jiàn)的中低質(zhì)粗飼料主要有玉米秸稈、小麥秸稈等，其特點(diǎn)是纖維素含量約占干物質(zhì)的60%，粗蛋白質(zhì)含量相對(duì)較低，消化率低，適口性差，直接飼喂這些中低質(zhì)粗飼料對(duì)反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不高[1]。對(duì)中低質(zhì)粗飼料進(jìn)行適當(dāng)?shù)募庸ぬ幚砟艽蠓岣咂淅寐剩绕涫巧锩附夥?，反?yīng)條件溫和、設(shè)備簡(jiǎn)單、能耗低，無(wú)污染，能有效提高飼料利用率。本文就纖維素酶提高對(duì)小麥秸稈的降解效率，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)纖維素酶降解小麥秸稈工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了纖維素酶降解小麥秸稈的最適條件，為有效提高纖維素酶的催化效率提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

纖維素酶，河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生化物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；小麥秸稈，采摘河南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，處理為干物質(zhì)，粉碎過(guò)40目篩待用；葡萄糖、乙酸-乙酸鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，均為分析純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；3,5-二硝基水楊酸(上海譜振生物科技有限公司)。

電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)，DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SHA-C水浴恒溫振蕩器等。

1.2 分析方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[2]

1.2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液(10 mg/mL)

稱取(103±2)℃烘干至恒重的無(wú)水葡萄糖1 g，用水溶解并定容至100 mL。

1.2.1.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取7支洗凈烘干的25 mL試管，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，補(bǔ)充蒸餾水至10 mL，再各加入1.5 mL DNS后搖勻，沸水浴5min，冷卻后定容至25 mL，用分光光度計(jì)測(cè)定540 nm吸光度值。以葡萄糖量(mg)為橫坐標(biāo)，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 還原糖測(cè)定[3,4]

采用DNS法。[5]

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 底物濃度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

分別取終濃度(g/L)為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的秸稈樣品加入pH 4.8乙酸-乙酸鈉的緩沖溶液1.5 mL和10.0 g/L的纖維素酶樣0.5 mL于50℃的水浴鍋中反應(yīng)1h，每個(gè)樣品三次重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照。按照1.2.2測(cè)定還原糖的生成量，確定纖維素酶最適的底物濃度。

1.2.3.2 pH對(duì)纖維素酶催化效果的影響

取0.8 g/L秸稈樣品分別加入pH為4.0、 4.8、 5.6、 6.4、7.2的緩沖溶液1.5 mL和10.0g/L的纖維素酶樣0.5 mL于50℃的水浴鍋中反應(yīng)1h，每個(gè)樣品三次重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照。按照1.2.2測(cè)定還原糖的生成量。確定纖維素酶最適pH。

1.2.3.3 酶濃度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

取0.8 g/L秸稈樣品加入pH 4.8乙酸-乙酸鈉緩沖溶液1.5 mL，分別加入酶濃度(g/L)為5.0、10.0、20.0、40.0、100.0的纖維素酶樣0.5 mL于50℃的水浴鍋中反應(yīng)1h，每個(gè)樣品三次重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照。按照1.2.2測(cè)定還原糖的生成量，確定纖維素酶的最適濃度。

1.2.3.4 溫度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

取0.8 g/L秸稈樣品加入pH 4.8乙酸-乙酸鈉緩沖溶液1.5 mL和10.0 g/L纖維素酶樣0.5 mL分別于40、45、50、55、60℃的水浴鍋中反應(yīng)1h，每個(gè)樣品三次重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照。按照1.2.2測(cè)定還原糖的生成量。確定纖維素酶最適溫度。

1.2.3.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)纖維素酶催化效果的影響

取0.8 g/L小麥秸稈樣品加入pH 4.8乙酸-乙酸鈉緩沖溶液1.5 mL和10.0 g/L纖維素酶樣0.5 mL于50℃的水浴鍋中反應(yīng)，時(shí)間分別為1、6、12、18、24h，每個(gè)樣品三次重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照。按照1.2.2測(cè)定還原糖的生成量。確定纖維素酶最適反應(yīng)時(shí)間。

1.2.4 響應(yīng)面法對(duì)降解條件的優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken原理，以底物濃度(A)、pH(B)、酶濃度(C)、反應(yīng)溫度(D)和反應(yīng)時(shí)間(E)為自變量，設(shè)計(jì)五因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。應(yīng)用Design Expert8.06軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸及方差分析，確定各個(gè)因素的顯著性[6，7]。

表1 響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 底物濃度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

由圖1可知，隨著底物濃度的增大還原糖含量逐漸增加，底物濃度為0.8 g/L時(shí)還原糖含量最大，底物濃度繼續(xù)增大時(shí)還原糖含量開(kāi)始下降。可能是因?yàn)殡S著還原糖量的增加，纖維素酶的活性受到抑制。

2.1.2 pH對(duì)纖維素酶催化效果的影響

由圖2可知，隨著pH的增大還原糖含量逐漸增加，pH為4.8時(shí)還原糖含量最大。 pH繼續(xù)增大時(shí)還原糖含量下降明顯，因?yàn)檫^(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)降低酶的活性。

圖1 底物濃度對(duì)纖維素酶降解效果的影響

圖2 pH對(duì)纖維素酶降解效果的影響

2.1.3 酶濃度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

由圖3可知，隨著酶濃度的增大還原糖含量逐漸升高，濃度為20 g/L時(shí)還原糖含量最大，當(dāng)酶濃度繼續(xù)增大時(shí)還原糖含量開(kāi)始下降。酶濃度增大，導(dǎo)致酶和底物的碰撞幾率降低，結(jié)合底物能力下降。

2.1.4 溫度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

由圖4可知，隨著溫度升高還原糖含量逐漸增加，溫度為50℃時(shí)還原糖含量最大，溫度繼續(xù)升高時(shí)還原糖含量開(kāi)始下降。溫度對(duì)酶是雙重影響，隨著溫度的升高，酶活力增加，但達(dá)到一定溫度后酶蛋白因?yàn)闇囟壬叨冃?，酶活力開(kāi)始下降。

圖3 酶濃度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)纖維素酶催化效果的影響

由圖5可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)還原糖含量逐漸增加，8h～18h時(shí)還原糖含量上升非常緩慢，18h達(dá)到最大，以后開(kāi)始緩慢下降。因?yàn)殡S著還原糖含量的增加，還原糖抑制了纖維素酶的活性。

圖4 溫度對(duì)纖維素酶催化效果的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)纖維素酶催化效果的影響

2.2 纖維素酶對(duì)小麥秸稈降解的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以底物濃度、pH、酶濃度、溫度和時(shí)間為因素，還原糖新生成量為響應(yīng)值，應(yīng)用Design Expert8.0.6設(shè)計(jì)五因素三水平試驗(yàn)，各因素水平與試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2[6]。

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

續(xù)表2

注： 試驗(yàn)設(shè)計(jì)46個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，其中40個(gè)分析點(diǎn)。對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行建模

2.2.2 回歸模型的建立

用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，對(duì)以上46個(gè)數(shù)據(jù)建立二次響應(yīng)面回歸模型為：Y=-457.53302+106.11562*A+56.08620*B+0.61508*C+11.71187*D+1.22271*E+6.96875*A*B-0.12844*A*C-2.02750*A*D+1.16875*A*E-0.013203*B*C-0.76625*B*D-0.18542*B*E-0.010537*C*D-7.29167E-004*C*E-0.040583*D*E-49.62500*A2-2.22135*B2+1.75000E-004*C2-0.054667*D2+0.019653*E2，Y是預(yù)測(cè)的還原糖含量。

表3 響應(yīng)曲面二次多項(xiàng)式模型的方差分析

注：*差異不顯著(P>0.1000)；***差異顯著(P<0.0500)

方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3，該模型F值=16.25，P<0.0001，表明此模型具有高度的顯著性；該模型P=0.4071(P>0.1000)，差異不顯著。R2=0.9286，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有92.86%來(lái)源于所選變量；Radj2=0.8714，說(shuō)明建立的模型能夠解釋87.14%響應(yīng)值的變化；Adeq Precision=16.969，遠(yuǎn)大于5，可知回歸方程可信度很高，試驗(yàn)誤差較小。P值、R2、Radj2以及Adeq Precision等多項(xiàng)數(shù)值均顯示，該模型效果理想，適用于分析和預(yù)測(cè)纖維素酶對(duì)小麥秸稈降解生成還原糖量的變化。

2.2.3 各因素交互作用優(yōu)化分析

利用Design-Expert 8.0.6分析得到纖維素酶對(duì)小麥秸稈降解生成還原糖含量的相應(yīng)面分析圖，如圖6～10所示。

圖6 底物濃度 g/L(A)和pH(B)對(duì)還原糖含量的影響

圖7 底物濃度(A)和溫度(D)對(duì)還原糖含量的影響

圖8 底物濃度(A)和時(shí)間(E)對(duì)還原糖含量的影響

圖9 pH(B)和溫度(D)對(duì)還原糖含量的影響

圖10 酶濃度(C)和溫度(D)對(duì)還原糖含量的影響

圖6表示，在溫度45℃、時(shí)間12h和酶濃度20g/L時(shí)，底物濃度和pH之間相互作用對(duì)還原糖含量的影響。當(dāng)pH一定時(shí)，隨著底物濃度的增加，還原糖含量逐漸升高，在底物添加量為0.6g/L時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，pH在一定范圍內(nèi)，也呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)。圖7表示，在pH4.8、酶濃度20g/L、時(shí)間12h條件下，底物濃度和溫度相互作用對(duì)還原糖含量的影響。隨著底物濃度的增加，還原糖量逐漸增加，在底物濃度為0.6g/L時(shí)還原糖量達(dá)到最大值之后逐漸下降；隨著溫度的升高，還原糖量也逐漸增加，在溫度達(dá)到50℃時(shí)，還原糖量達(dá)到最大。圖8表示，在pH4.8、酶濃度20g/L、溫度45℃條件下，底物濃度和時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響。底物濃度為0.6g/L時(shí)達(dá)到最大，隨著濃度升高，還原糖生成量逐漸下降。當(dāng)時(shí)間在12h時(shí)還原糖量達(dá)到最大，之后逐漸下降。從等高線可知，時(shí)間在一定范圍內(nèi)，底物濃度對(duì)還原糖生成量影響較大。圖9表示，在底物濃度0.6g/L、酶濃度20/L、時(shí)間為12h，pH和溫度對(duì)還原糖含量的影響。從等高線可以看出，pH對(duì)還原糖生成量影響較大。圖10表示，在pH 4.8、底物濃度0.60g/L、時(shí)間12h，隨著酶濃度增加，還原糖含量在逐漸降低，隨著溫度升高還原糖量也在升高，從等高線可以看出，酶濃度響應(yīng)面坡度角較大，其對(duì)還原糖生成量影響也較大。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)就纖維素酶對(duì)小麥秸稈降解過(guò)程中各因素對(duì)降解效果的影響，各因素次序?yàn)槊笣舛?底物濃度>pH>時(shí)間>溫度，上述結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，酶添加量對(duì)降解效果影響較大，與禚同友研究相吻合[8]。其次為底物濃度、pH的影響。時(shí)間對(duì)還原糖的含量也有一定的影響，導(dǎo)致酶降解率降低。適宜的溫度有利于提高酶解效率，溫度過(guò)高或過(guò)低均導(dǎo)致酶失活，降解率下降。本實(shí)驗(yàn)所得最佳降解條件為：底物濃度0.6 g/L、酶濃度20.0 g/L、酶反應(yīng)溫度50℃、pH 4.8、酶反應(yīng)時(shí)間12 h。