王 鵬，王文靜

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院， 河南 鄭州 450000)

苦皮藤(CelastrusangulatusMax.)屬于衛(wèi)矛科(Celastraceae)南蛇藤屬(Celastrus)植物[1]。因苦皮藤的根皮和種子內(nèi)含有殺蟲(chóng)的活性成分[2-4]，在我國(guó)民間就有用于其根粉防治蔬菜害蟲(chóng)的傳統(tǒng)[2]。在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中也有從苦皮藤根皮中提取有效成分制成生物農(nóng)藥，用于防治植物有害昆蟲(chóng)[5-8]。雖然利用苦皮藤根皮粉或根皮提取物制成的生物農(nóng)藥防治害蟲(chóng)效果明顯[9-10]，但野生的苦皮藤數(shù)量有限，采挖易造成水土流失，破壞生態(tài)環(huán)境。研究表明，苦皮藤種子不能自我繁殖，人工播種也不能發(fā)芽，人工培育的苦皮藤苗木主要以根插繁殖為主[11]，其次也有使用組織培養(yǎng)進(jìn)行繁殖的研究[12-13]，但對(duì)利用種子進(jìn)行繁殖的研究鮮有報(bào)道。經(jīng)調(diào)查，苦皮藤雌株每年都有大量的種子產(chǎn)生，如果使用種子播種，每年都可繁育大量的苗木，成本低，快速便捷，可充分滿足市場(chǎng)對(duì)苦皮藤植物的需求。本文利用苦皮藤成熟種子，開(kāi)展不同處理對(duì)苦皮藤種子萌發(fā)影響的試驗(yàn)，尋求打破苦皮藤種子繁殖的瓶頸，這將對(duì)苦皮藤資源的開(kāi)發(fā)和利用具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

采集已成熟的苦皮藤種子，采集時(shí)間：2017年11月10日-15日，采集地點(diǎn)：河南南召伏牛山。

1.2 方法

將采來(lái)的苦皮藤果實(shí)剝?nèi)スず图t色的假種皮，露出褐色的種子，將種子用清水漂洗，置陰涼干燥處晾干，篩撿出籽粒飽滿的種子，做如下處理：

1.2.1 沙藏 露地沙藏和冰箱中沙藏

露地沙藏：先將種子、河沙分別用0.3%的高錳酸鉀消毒，將消毒的河沙調(diào)成用手握成團(tuán)一松即散的濕度。按照種子：沙=1:3的比例混合，放入20cm深的坑中貯藏。冰箱中貯藏：按上述方法將種子與河沙放在消毒過(guò)的保鮮盒中，放入4℃冰箱中貯藏。露地沙藏和冰箱中沙藏的種子，經(jīng)30、45、60、75、90d處理后，播種于128穴盤(pán)中，置于人工智能氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每7d統(tǒng)計(jì)一次萌芽率。穴盤(pán)基質(zhì)配比為1/3草炭+1/3蛭石+1/3珍珠巖(下同)；人工智能氣候培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件即時(shí)間、光照、溫度、濕度分別是：2h、500lx、18℃、85%，2h 1000lx、20℃、85%，8h、1500lx、25℃、85%，2h、1000lx、20℃、85%，2h、500lx、18℃、85%，8h、0lx、15℃、85%，如此每天一個(gè)周期循環(huán)(下同)。

1.2.2 溫、開(kāi)水浸種處理

將種子分別用20、40、60、80、100℃水浸種處理，將處理后的種子播種于128穴盤(pán)中，置于人工智能氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周統(tǒng)計(jì)一次萌芽率。

1.2.3 GA3浸種處理

將種子分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·L-1的GA3浸種20min，將處理后的種子播種于128穴盤(pán)中，放置于人工智能氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周統(tǒng)計(jì)一次萌芽率。

1.2.4 種子切皮處理

用手術(shù)刀將種子的種皮切開(kāi)、切縫或削切掉一部分，露出種子里面胚的部分。將處理后的種子播種于128穴盤(pán)中，置于人工智能氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周統(tǒng)計(jì)一次萌芽率。

1.2.5 種子切胚培養(yǎng)試管苗

(1)培養(yǎng)基配制：1/2MS+0.5mg·L-1NAA

(2)接種：將經(jīng)過(guò)滅菌處理過(guò)的種子，在超凈工作臺(tái)上用手術(shù)刀進(jìn)行切胚處理，然后接種于培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg·L-1NAA的培養(yǎng)瓶中，置于人工智能氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每7d觀察一次。接種數(shù)量為48瓶，每瓶3粒-4粒種子。

1.2.6 種子直播

將采回來(lái)的苦皮藤種子直接播種于苗圃苗床中，保持土壤濕潤(rùn)，每15d統(tǒng)計(jì)一次。將一部分種子室內(nèi)貯藏到第二年4月15日直接播種于苗圃苗床中，保持土壤濕潤(rùn)，每15d統(tǒng)計(jì)一次。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙藏處理對(duì)苦皮藤種子萌芽的影響

分別將經(jīng)過(guò)30、45、60、75、90d露地沙藏、冰箱中沙藏處理過(guò)的種子播種于128穴盤(pán)中，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 沙藏處理苦皮藤種子萌芽情況 %

發(fā)芽率：發(fā)芽的種子數(shù)占播種種子數(shù)的百分比(下同)

兩種沙藏處理過(guò)的種子，發(fā)芽率均為0。對(duì)沒(méi)有發(fā)芽的種子進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，經(jīng)30d-60d處理過(guò)的種子，大部分種子子葉淡綠色，蜷縮于種子內(nèi)；75d-90d的種子，大部分種子內(nèi)的子葉褐化，充滿水分，其原因可能是沙藏30d-60d的種子胚已經(jīng)發(fā)育，子葉萌發(fā)，但由于種皮緊固而不能突破，直至60d以后，種子內(nèi)部的水分積聚，氧氣缺乏，種子內(nèi)的酶失去活性，種胚死亡。

從解剖結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)沙藏處理過(guò)的種子，種皮逐漸軟化，恢復(fù)了吸收能力，盡管內(nèi)部的胚萌動(dòng)，但也沒(méi)有足夠的能力突破種皮。沙藏處理過(guò)的種子不發(fā)芽可能是種皮中某種物質(zhì)的存在致使種皮牢固而不易被突破的原因所致。

2.2 溫、開(kāi)水浸種處理對(duì)苦皮藤種子萌芽的影響

經(jīng)不同溫度的水浸種后播種，苦皮藤種子萌芽情況如表2所示。

表2 不同溫度的水浸處理苦皮藤種子萌芽情況 %

從表2中可以看出，20、40℃的溫水處理，苦皮藤種子沒(méi)有發(fā)芽；60℃的熱水處理，發(fā)芽率為4.6%，80℃的熱水處理,發(fā)芽率為12.5%，100℃的開(kāi)水處理，發(fā)芽率為46.5%。溫開(kāi)水處理的主要作用是軟化種皮，增強(qiáng)種子的吸水能力。從沙藏的種子種皮軟化但仍沒(méi)有發(fā)芽的情況來(lái)看，苦皮藤種皮中可能有其他物質(zhì)的存在，使用100℃的開(kāi)水燙種，可使這類(lèi)物質(zhì)的作用解除。另外，也可能是高溫使種皮快速軟化，種子內(nèi)部快速獲得水分，酶的活性快速被激活所致。60、80℃的熱水還不能達(dá)到快速軟化種皮的作用，因此發(fā)芽率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于100℃的開(kāi)水燙種處理。

2.3 不同濃度的GA3浸種處理對(duì)苦皮藤種子萌芽的影響

使用不同濃度的GA3浸種處理后，苦皮藤種子的萌芽情況如表3所示。

表3 不同濃度的GA3浸種處理苦皮藤種子萌芽情況 %

從表3中可以看出，經(jīng)不同濃度GA3處理過(guò)的苦皮藤種子，播種后都沒(méi)有發(fā)芽。GA3具有打破種子生理休眠的作用[14]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦皮藤種子經(jīng)GA3處理后沒(méi)有發(fā)芽，說(shuō)明苦皮藤種子不能萌發(fā)不是因?yàn)樯硇菝叩脑颍瑯O有可能是因?yàn)榉N子種皮致密，GA3不能進(jìn)入種子內(nèi)部，對(duì)種子的萌發(fā)起不到調(diào)節(jié)作用所致。

2.4 切種皮處理對(duì)苦皮藤種子萌發(fā)的影響

經(jīng)不同方法切種皮處理過(guò)的苦皮藤種子，播種后的萌芽率如表4所示。

表4 切種皮處理苦皮藤種子萌芽情況 %

從表4中可以看出，播種第7d時(shí)萌芽率為3.0%，14d時(shí)萌芽率為15.4%，21d時(shí)萌芽率為22.5%，28d時(shí)為26.0%，35d時(shí)萌芽率(26.2%)沒(méi)有顯著增加?？梢?jiàn)，切種皮處理有助于苦皮藤種子萌發(fā)，在播種近一個(gè)月時(shí)(28d)，萌芽率為26.0%，但遠(yuǎn)低于燙種處理46.5%的發(fā)芽率。切去種子的種皮，可以讓種子直接吸水，發(fā)芽較早，7d時(shí)已有少量發(fā)芽，隨后發(fā)芽率逐步增加。經(jīng)對(duì)發(fā)芽和沒(méi)有發(fā)芽的種子進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽的種子切皮的位置在胚根處或臨近胚根的一端，而沒(méi)有發(fā)芽的種子切皮的位置在胚根的遠(yuǎn)端和只對(duì)種皮切縫處理。沒(méi)有發(fā)芽的種子，雖然種子已充分吸水，胚的活性增加，但由于種皮的原因,胚根沒(méi)能及時(shí)突破堅(jiān)固的種皮，但也有少量(約5.0%)是因?yàn)榕卟](méi)有完全形成。燙種處理能使整個(gè)種皮軟化、結(jié)構(gòu)疏松，所以發(fā)芽率大于切種皮處理過(guò)的種子。

2.5 種子切胚培養(yǎng)對(duì)苦皮藤種子萌發(fā)的影響

采用植物組織培養(yǎng)的方法，將切胚的種子接種于1/2MS+0.5mg·L-1NAA培養(yǎng)基中，除了約有8%的污染外，接種后的萌芽情況表5所示。

表5 種子切胚培養(yǎng)苦皮藤種子萌芽情況 %

從表5中可以看出，在切胚培養(yǎng)7d時(shí)，有1.8%的子葉萌發(fā)和0.5%的根萌出。培養(yǎng)14d時(shí)萌發(fā)率升高，產(chǎn)生子葉的有10.0%，產(chǎn)生根的有1.6%，產(chǎn)生根莖葉的有2.0%。在培養(yǎng)21、28d時(shí)，子葉、根和根莖葉的萌發(fā)率都升高，在培養(yǎng)28d時(shí)達(dá)到最高，分別是：只有子葉萌發(fā)的占38.5%，只有根伸出的有2.4%，根莖葉全株的有11.5%，個(gè)別植株主根伸長(zhǎng)到6cm左右，須根普遍較少。在培養(yǎng)35d時(shí)，開(kāi)始有部分子葉產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象，萌發(fā)的子葉下降到31.5%；全株萌發(fā)的子葉也有發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，尤其是臨近培養(yǎng)基的子葉，萌發(fā)的植株下降到8.4%；根的萌發(fā)率為2.5%，較21、28d時(shí)沒(méi)有顯著增加。培養(yǎng)到42d時(shí)，子葉的玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重，根的伸長(zhǎng)也開(kāi)始衰弱，子葉的萌發(fā)率只剩下22.4%，全株的存活率也下降到6.8%，根的萌發(fā)沒(méi)有變化。上述現(xiàn)象表明，切胚處理能夠促進(jìn)子葉和根的萌發(fā)，但能夠生成全株的種子并不多，這與切胚時(shí)將種子一切為二有關(guān)，也可能與培養(yǎng)基的激素成分有關(guān)。NAA是屬于生長(zhǎng)激素類(lèi)，單獨(dú)使用只有利于根的萌發(fā)[15]，這也是個(gè)別植株的根能夠長(zhǎng)到6cm以上的原因。全株萌發(fā)的植株，根顯著增長(zhǎng)，子葉雖有萌發(fā)，但新的幼葉和胚芽、胚軸都沒(méi)有明顯的變化。因此，要想依靠切胚培養(yǎng)獲得大量的可以移栽的植株，還需要調(diào)整培養(yǎng)基中激素的成分和含量進(jìn)行試驗(yàn)研究。

2.6 大田直接播種對(duì)苦皮藤種子萌發(fā)的影響

將采回的苦皮藤種子直接播種于大田中，萌芽情況如表6所示。

表6 大田直接播種苦皮藤種子萌芽情況 %

由表6中可以看出，苦皮藤種子成熟后隨采隨播和室內(nèi)貯藏于第二年春播都不能使種子發(fā)芽。對(duì)沒(méi)有發(fā)芽的種子進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，有的內(nèi)部的子葉和胚都很完整，有的沒(méi)有完全形成，有的子葉發(fā)黃，有的種子內(nèi)部完全腐爛，但從外觀來(lái)看，種子完好，顏色發(fā)暗，種皮軟化。這種現(xiàn)象與沙藏處理過(guò)的種子有相似之處。結(jié)果表明，直播的種子不發(fā)芽還是由于種皮緊固的原因所致。

3 結(jié)論

影響種子萌發(fā)有內(nèi)外兩種因素，外因主要是水分、溫度、氧氣、光照等，內(nèi)因主要是休眠的作用[16-19]。從外因來(lái)看，充足的水分、適宜的溫度、充足的氧氣，三者缺一不可。根據(jù)以上分析，高溫浸種、切種皮處理和切胚培養(yǎng)都能誘導(dǎo)種子萌發(fā)，而沙藏處理(露地沙藏、冰箱中沙藏)、不同濃度的赤霉素處理和播種都不能使苦皮藤種子萌發(fā)，這都與致密的種皮有關(guān)。開(kāi)水燙種使致密的種皮快速軟化吸水、吸氧，切種皮和切胚都能使種子直接吸水、吸氧，為種子的萌發(fā)創(chuàng)造條件；沙藏處理、赤霉素處理和直接播種都不能使種子的種皮快速軟化吸水、吸氧，當(dāng)經(jīng)貯藏播種后，種皮得到了軟化，水分進(jìn)入了種子內(nèi)部，種胚活動(dòng)，但胚根不能突破種皮，直至種胚死于胎中，這可能是種皮中有一些物質(zhì)的存在致使種皮纖維依然緊密相連。從切胚和切皮培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)來(lái)看，引起苦皮藤種子休眠的內(nèi)因還是種皮，突破了種皮，也就打破了休眠。

綜合以上,高溫燙種(100℃)能夠促進(jìn)苦皮藤種子萌發(fā)，發(fā)芽率最高為46.5%；切種皮處理也可促進(jìn)苦皮藤種子萌發(fā)，播種45d時(shí)發(fā)芽率達(dá)到26.2%，發(fā)芽率低于高溫燙種，這與切皮的位置有關(guān)；切胚培養(yǎng)也能誘導(dǎo)苦皮藤種子發(fā)芽，但形成的植株移栽成活的難度大；沙藏處理、赤霉素浸種和直接播種都不能使苦皮藤種子發(fā)芽。