王 煜，羅園渠，楊珊珊，李云章

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

近年來，國內(nèi)馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，馬術(shù)和賽馬運(yùn)動在國內(nèi)正蓬勃發(fā)展。2016年國內(nèi)舉辦各級別賽馬和馬術(shù)比賽超過100場，馬匹競技運(yùn)動在國內(nèi)發(fā)展日新月異。大量的訓(xùn)練和比賽導(dǎo)致馬匹軟組織損傷發(fā)病率很高，日本中央競馬會純血馬病例報告中有11.3%是指淺屈肌腱炎[1]，美國加州南部馬場馬匹該病發(fā)生率為15.3%[2]。

治療馬匹肌腱損傷主要是非甾體抗炎藥，肌腱損傷治療期長，長期用藥胃潰瘍發(fā)生幾率上升，同時可能導(dǎo)致腎臟損傷、心血管疾病、結(jié)腸炎癥和蹄葉炎等[3]。開發(fā)一種效果好、副作用低的治療肌腱損傷的藥物十分必要。

1984年Williams I F等[4]用馬作為試驗(yàn)動物，對比了膠原酶誘導(dǎo)的肌腱炎和外傷性肌腱炎愈后疤痕組織的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)膠原酶誘導(dǎo)的肌腱炎的修復(fù)過程與外傷性肌腱炎的修復(fù)過程和愈后程度相似度較高，此后膠原酶誘導(dǎo)肌腱炎模型成為研究馬肌腱炎的常用的模型[5-8]。

ZD制劑為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院驗(yàn)方，對動物軟組織損傷具有良好的抗炎消腫、活血化淤、促進(jìn)組織恢復(fù)、毒副作用低、安全性高等特點(diǎn)[9-10]。本研究選用馬匹作為試驗(yàn)動物，建立馬指淺屈肌腱炎模型，應(yīng)用超聲影像學(xué)方法探索ZD制劑對馬匹軟組織損傷的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品及試劑 ZD制劑膏劑，實(shí)驗(yàn)室自制；細(xì)菌膠原酶Ⅰ型，Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Mylab 30 Vet獸醫(yī)B超機(jī)，Esaote公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)用動物 健康蒙古馬12匹，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物園提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)馬匹準(zhǔn)備 將12匹馬采用隨機(jī)化分組，分為試驗(yàn)藥物組、陽性藥物組和陰性藥物組3組，每組4匹。對試驗(yàn)馬匹進(jìn)行全身檢查，左前肢進(jìn)行視診、觸診，跛行診斷，X光獲取掌骨背掌位、正側(cè)位圖像，B超檢測馬匹指淺屈肌腱，橫切和縱切圖像各獲取3張，測量數(shù)據(jù)，確保該肢正常。

1.2.2 馬指淺屈肌腱炎模型誘導(dǎo) 靜脈注射靜松靈1.5 mL鎮(zhèn)靜馬匹，剃去左前掌部毛發(fā)，然后用肥皂水洗和酒精消毒。將0.1 mL生理鹽水稀釋的26 800 u細(xì)菌膠原酶Ⅰ超聲引導(dǎo)注入指淺屈肌腱內(nèi)，50 g/L碘酊消毒。48 h內(nèi)觀察記錄馬匹精神、跛行情況、造模部位腫脹情況(圖1)。

圖1 注入膠原酶Ⅰ部位，圖中標(biāo)記部分為注射器針頭

1.2.3 指淺屈肌腱炎模型治療及評估

1.2.3.1 給藥方法 造模后48 h，試驗(yàn)藥物組馬匹外敷ZD制劑，均勻涂布3 mm；二甲基亞砜配成90%液體[11]，外敷于陽性藥物組，每匹馬50 g；陰性藥物組外敷生理鹽水代替中藥藥液的膏劑。所有馬匹每2 d換1次藥。

1.2.3.2 檢測方法 造模后48 h、7 d、15 d、30 d、45 d、60 d、75 d、90 d用B超檢測肌腱損傷發(fā)展情況和愈合情況，使用B超機(jī)自帶肌腱測量工具包，獲取損傷部位肌腱整體橫切圖像面積、損傷區(qū)域面積。根據(jù)回聲強(qiáng)弱，對損傷區(qū)域評分，評分標(biāo)準(zhǔn)[12]如下：正?；芈?分，微弱低回聲1分，輕度低回聲2分，中度低回聲3分，高度低回聲4分。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 統(tǒng)計數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用方差分析進(jìn)行差異性比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 馬匹試驗(yàn)前檢查結(jié)果

臨床檢查試驗(yàn)馬匹，造模部位觸診，局部無腫、熱、痛，硬地慢步和快步檢查未見跛行。X光檢查見未見異常。B超檢查見圖2，指淺屈肌腱橫切回聲均勻，未見低回聲區(qū)；縱切回聲均勻，腱纖維連續(xù)，未見中斷。B超檢查未見異常。

2.2 馬指淺屈肌腱炎模型造模結(jié)果

造模4 h后所有馬匹均明顯跛行，運(yùn)步困難，造模肢體掌部腫脹明顯。未鎮(zhèn)靜下觸診，躲閃拒絕檢查。鎮(zhèn)靜后觸診，造模部位明顯腫脹。造模后48 h，硬地慢步檢查跛行明顯。馬匹不愿快步，快步檢查無法進(jìn)行。造模后48 h獲取造模肢體X光背掌位和正側(cè)位圖像，未發(fā)現(xiàn)骨骼異常。造模后48 h掃查造模肌腱，橫斷面發(fā)現(xiàn)低回聲區(qū)域，縱切面纖維排列遭到破壞，圖3中箭頭位置為損傷區(qū)域，指淺屈肌腱病變明顯，符合指淺屈肌腱炎超聲特性。

圖2 造模前肌腱超聲圖像

圖3 造模后肌腱超聲圖像

2.3 肌腱超聲圖像變化

圖4～圖13為試驗(yàn)藥物組部分肌腱超聲橫切圖和縱切圖。

圖4 造模后1 d試驗(yàn)藥物組肌腱圖像

圖10和圖11為陽性藥物組部分肌腱超聲橫切和縱切圖，圖12和圖13為陰性藥物組部分肌腱超聲橫切圖和縱切圖。

圖5 造模后15 d試驗(yàn)藥物組肌腱圖像

圖6 造模后30 d試驗(yàn)藥物組肌腱圖像

圖7 造模后60 d試驗(yàn)藥物組肌腱圖像

圖8 造模后75 d試驗(yàn)藥物組肌腱圖像

圖9 造模后90 d試驗(yàn)藥物組肌腱圖像

圖10 造模后1 d陽性藥物組肌腱圖像

圖11 造模后90 d陽性藥物組肌腱圖像

圖12 造模后1 d 陰性性藥物組肌腱圖像

2.4 肌腱總面積變化

由圖14可知，由于造模后肌腱發(fā)生腫脹，肌腱總面積在造模后15 d時最大，3組馬匹肌腱總面積差異不顯著(P>0.05)。

2.5 肌腱消腫效果

由圖14和和表1可知，到造模后90 d，試驗(yàn)藥物組肌腱面積縮小大于陽性藥物組和陰性藥物組，差異均極顯著(P<0.01)。陽性藥物組肌腱面積縮小大于陰性藥物組，差異極顯著(P<0.01)。

圖13 造模后90 d陰性藥物組肌腱圖像

圖14 肌腱總面積

組別Groups15 d肌腱面積/mm215 d tendon area90 d肌腱面積/mm290 d tendon area肌腱面積變化/mm2The change of tendon area試驗(yàn)藥物組Test drug group76.00±1.5150.15±1.2426.04±1.11**陽性藥物組 Posi-tive drug group78.33±1.2663.03±1.3315.15±1.06**陰性藥物組 Nega-tive drug group76.99±1.3171.23±1.036.11±1.18

注：與陰性藥物組、陽性藥物組比較，**表示P<0.01。

Note:Compared with negative drug group and positive drug group,** indicatesP<0.01.

2.6 肌腱最大損傷面積

由圖15可知，肌腱損傷面積在15 d時達(dá)到最大，3組肌腱損傷區(qū)域面積差異不顯著(P>0.05)。

2.7 肌腱損傷愈合效果

由圖15和表2可知，到90 d時試驗(yàn)藥物組肌腱損傷面積為0 mm2，表明損傷愈合；而陽性藥物組和陰性藥物組肌腱損傷仍然存在。分別比較90 d時試驗(yàn)藥物組與陽性藥物組、陰性藥物組的肌腱損傷區(qū)域面積變化，差異均極顯著(P<0.01)。陽性藥物組與陰性藥物組比較肌腱損傷區(qū)域面積變化，差異極顯著(P<0.01)。

圖15 肌腱損傷區(qū)域面積

組別Groups15 d損傷面積/mm215 d tendon damage area90 d損傷面積/mm290 d tendon damage area損傷區(qū)域面積變化/mm2The change of tendon damage area試驗(yàn)藥物組Test drug group9.08±0.250.00±0.009.00±0.58**陽性藥物組 Posi-tive drug group9.15±0.236.09±0.243.00±1.17**陰性藥物組 Nega-tive drug group8.38±0.148.32±0.190.42±0.39

注：與陰性藥物組、陽性藥物組比較，**表示P<0.01。

Note:Compared with negative drug group and positive drug group,** indicatesP<0.01.

2.8 肌腱超聲回聲評分

肌腱超聲回聲評分見表3。肌腱損傷在15 d達(dá)到最大值，對造模第15天各組肌腱損傷區(qū)域超聲回聲評分分別比較，差異不顯著(P>0.05)。

造模第90天試驗(yàn)藥物組損傷愈合，分別比較此時各組評分，試驗(yàn)藥物組比陽性藥物組、陰性藥物組評分低，差異均極顯著(P<0.01)，陽性藥物組比陰性藥物組評分低，差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 膠原酶誘導(dǎo)肌腱炎的機(jī)理和特點(diǎn)

肌腱由多級纖維性亞單位組成，膠原纖維組成初級腱纖維束，初級腱纖維束組成二級腱纖維束，二級腱纖維束組成肌腱。膠原蛋白占據(jù)肌腱干重的80%左右，其中有95%是Ⅰ型膠原蛋白。將細(xì)菌膠原蛋白酶Ⅰ注入肌腱后，膠原蛋白酶降解肌腱內(nèi)膠原蛋白，使腱纖維的連續(xù)性遭到破壞，形成非開放性炎癥。由于腱纖維的破壞、結(jié)構(gòu)改變、炎癥的產(chǎn)生，肌腱在拉伸和收縮時，產(chǎn)生劇烈疼痛，馬匹呈現(xiàn)跛行。膠原蛋白酶誘導(dǎo)的肌腱炎模型亦具有一般炎癥的紅、腫、熱、痛和機(jī)能障礙等臨床癥狀。

表3 肌腱損傷區(qū)域超聲評分

注：同行數(shù)據(jù)比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

Note:Compared with the same line data,* indicatesP<0.05,and ** indicatesP<0.01.

由于機(jī)體代謝膠原蛋白酶需要時間和組織的修復(fù)，Wallis T W等[13]試驗(yàn)顯示，膠原蛋白酶誘導(dǎo)的肌腱炎模型一般在14 d左右達(dá)到穩(wěn)定。在14 d左右肌腱損傷面積基本趨于穩(wěn)定，在此之前肌腱損傷區(qū)域面積一直在不斷擴(kuò)大。

腱纖維被膠原蛋白酶降解后，產(chǎn)生的炎性液體、腱纖維的斷裂和出血導(dǎo)致超聲掃查時肌腱回聲強(qiáng)度發(fā)生改變，呈無回聲或低回聲狀態(tài)；肌腱水腫，肌腱橫斷面積變大；縱切時肌腱厚度增加，纖維平行結(jié)構(gòu)丟失[14]。損傷愈合時，損傷區(qū)域回聲強(qiáng)度增強(qiáng)，橫斷面面積減小，縱切面纖維平行結(jié)構(gòu)重建。

3.2 指淺屈肌腱炎模型的建立

本試驗(yàn)使用細(xì)菌膠原蛋白酶Ⅰ誘導(dǎo)的指淺屈肌腱炎模型，造模部位出現(xiàn)明顯的腫脹、疼痛，造模肢體跛行明顯。造模1 d后，超聲橫切圖像出現(xiàn)明顯低回聲或無回聲區(qū)，縱切圖像可見明顯腱纖維連續(xù)性遭到破壞，出現(xiàn)低回聲或無回聲區(qū)，符合肌腱炎模型超聲特點(diǎn)[15]。各試驗(yàn)組肌腱總體面積、損傷區(qū)域面積在15 d達(dá)到最大值，且各試驗(yàn)組肌腱總面積、損傷區(qū)域面積無統(tǒng)計學(xué)差異，表明指淺屈肌腱炎模型平行性較好。綜上所述，本試驗(yàn)誘導(dǎo)的指淺屈肌腱炎模型，符合肌腱炎的臨床特征、超聲影像特性和膠原酶誘導(dǎo)肌腱炎模型的特點(diǎn)，表明造模成功。

3.3 ZD制劑對指淺屈肌腱炎模型消腫效果

屈肌腱炎和懸韌帶炎被俗稱為“漲筋”，在外觀上患部出現(xiàn)明顯腫脹。炎癥的腫脹是由局部組織充血和炎性滲出導(dǎo)致，指淺屈肌腱炎腫脹的產(chǎn)生在于腱束的斷裂，膠原纖維間和疏松結(jié)締組織內(nèi)發(fā)生溢血，局部血管擴(kuò)張，血管滲透性改變，血管內(nèi)液體滲出，腱內(nèi)組織液積聚，膠原纖維發(fā)生腫脹，造成局部水腫[8]。而膠原蛋白酶誘導(dǎo)的指淺屈肌腱炎模型通過膠原蛋白酶消化腱纖維，使腱纖維斷裂、連續(xù)性破壞，導(dǎo)致溢血、血管通透性增強(qiáng)和腱內(nèi)組織液積聚，使得造模部位發(fā)生明顯的腫脹現(xiàn)象。

腫脹的消除代表著溢血的吸收、炎性水腫的消散和組織結(jié)構(gòu)的愈合，是指淺屈肌腱炎改善的一個重要指標(biāo)。由表1可知，ZD制劑對膠原蛋白酶誘導(dǎo)的指淺屈肌腱炎模型消腫效果極顯著優(yōu)于DMSO組和陰性藥物組。

臨床治療指淺屈肌腱炎原則是減少滲出，促進(jìn)吸收，防止腱束的繼續(xù)斷裂，恢復(fù)功能。ZD制劑中藥組方中沒藥具有改善微循環(huán)和血液流變學(xué)的作用。當(dāng)歸活血補(bǔ)血、抗氧化和消除自由基。紅花活血通經(jīng)、散淤止痛；透骨草舒筋活血，祛風(fēng)止痛。柏合[10]證明本ZD制劑具有降低血管通透性、改善微循環(huán)，縮短組織修復(fù)的時間，可顯著改善炎癥引起的腫脹。王未[9]和柏合[10]用ZD制劑治療馬肌腱炎模型時發(fā)現(xiàn)，ZD制劑顯著降低炎癥反應(yīng)中炎性介質(zhì)NO、COX-2、IL-1β和IL-6，降低炎癥反應(yīng)，提升IL-8和IL-10的含量，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。ZD制劑對膠原蛋白酶誘導(dǎo)的指淺屈肌腱炎模型消腫效果顯著，可能與其良好的活血化淤作用和改善NO、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-8、IL-10有關(guān)系。

而DMSO抗炎的主要機(jī)理是清除自由基，與抑制炎性細(xì)胞向發(fā)炎部位侵入作用共同完成[3,11]，不能在慢性炎癥期較好地促進(jìn)淤血、水腫消散，降解壞死組織，可能是DMSO治療指淺屈肌腱炎效果不及ZD制劑的原因。

3.4 ZD制劑對指淺屈肌腱炎模型的組織重建作用

肌腱炎的恢復(fù)時，受損的部位逐漸形成新的纖維組織和肉芽組織，最后形成瘢痕愈合。愈合的肌腱損傷部位回聲強(qiáng)度由低回聲逐漸增強(qiáng)，預(yù)示著肌腱組織的重建[4]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)藥物組超聲圖像中的肌腱損傷區(qū)域面積穩(wěn)定減少，表明損傷區(qū)域的穩(wěn)定減少；而且超聲回聲強(qiáng)度也同步逐漸增強(qiáng)，這預(yù)示著損傷肌腱炎性水腫的消散和新組織的再生。

由表2可以得知，ZD制劑對指淺屈肌腱炎模型受損面積改善上有著顯著的效果。由表3則可以看出，使用ZD制劑的試驗(yàn)藥物組受損肌腱的回聲強(qiáng)度增強(qiáng)最快，ZD制劑對由膠原蛋白酶誘導(dǎo)的指淺屈肌腱炎模型組織重建效果明顯高于DMSO組和陰性藥物組。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明膠原蛋白酶可誘導(dǎo)馬屈肌腱發(fā)生炎癥。

ZD制劑外敷對膠原蛋白酶誘導(dǎo)的肌腱炎治療效果優(yōu)于DMSO組和陰性藥物組。