張振東，楊亞軍，劉希望，馬 寧，申棟帥，李劍勇

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730050)

乙酰氨基阿維菌素是由默克公司1997年開發(fā)出的大環(huán)內(nèi)酯類體內(nèi)外殺蟲劑，是一種高效、廣譜、低殘留的獸用新一代抗寄生蟲藥物[1-3]。乙酰氨基阿維菌素具有廣譜、高效、用量小和安全程度高等優(yōu)點(diǎn)，對線蟲、昆蟲及螨蟲均具有高效殺滅作用[4]。目前，國內(nèi)商品化的制劑只有1% EPR注射液，其作為國家二類新獸藥由河北威遠(yuǎn)動(dòng)物藥業(yè)有限公司等注冊生產(chǎn)[5]。臨床主要應(yīng)用于奶牛、肉牛等動(dòng)物，在羊、豬、兔等其他動(dòng)物上進(jìn)行的試驗(yàn)也取得了較好的治療效果[6-7]。但EPR注射液皮下注射給藥，生物利用度低、藥效維持時(shí)間短，從而給臨床治療效果帶來嚴(yán)重影響。因此，提高生物利用度和延長有效血藥濃度的EPR新劑型開發(fā)成為近年來國內(nèi)外防治寄生蟲病的研究熱點(diǎn)[8]。本團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種EPR原位凝膠注射劑，擬用于奶牛、肉牛寄生蟲病的治療。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，采用一種快速簡便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的高效液相色譜法測定EPR原位凝膠注射劑中有效成分EPR的含量，可用于EPR原位凝膠注射劑的質(zhì)量控制[9]，旨在為該原位凝膠注射劑的進(jìn)一步應(yīng)用提供檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 乙酰氨基阿維菌素對照品(B1a含量為95.4%，B1b含量為2.37%，批號(hào)K0471411)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；EPR原位凝膠注射劑3批(批號(hào)170816、170919、171016)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所獸藥研究室研制。

1.1.2 主要儀器 Agilent-LC 1290Ⅱ高效液相色譜儀(G7120A泵，G7114B紫外檢測器，OpenLAB CDS中文色譜工作站)，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；CPA224S電子天平，德國賽多利斯公司產(chǎn)品；優(yōu)普超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 乙睛，甲醇(色譜純)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈∶水∶甲酸(60 mL∶40 mL∶0.04 mL)；流速：0.4 mL/min；紫外檢測波長：245 nm；柱溫：35℃，進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取乙酰氨基阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品102 mg，加無水乙醇定容至100 mL，得濃度為1.02 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。使用前用流動(dòng)相稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

1.2.3 供試品溶液的制備 EPR原位凝膠注射劑搖勻，用移液管精確量取1 mL，置50 mL容量瓶中，用無水乙醇25 mL，分5次洗滌移液管內(nèi)壁，洗液并入容量瓶中，搖勻，置水浴中超聲10 min，加無水乙醇緩慢稀釋至刻度，搖勻。精確量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確量取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量加到流動(dòng)相中，得濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL的對照品溶液，各取2 μL進(jìn)樣測定，以峰面積(y)對EPR濃度(x)進(jìn)行線性回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 取EPR對照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量2 μL，依法測定峰面積，觀察其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在供試品溶液制備0、4、8、12、24 h后，精確量取2 μL，依法測定峰面積，考察其穩(wěn)定性[10-11]。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次EPR原位凝膠注射劑6份，按照1.2.3中的方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣測定峰面積，計(jì)算其RSD。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精確取EPR對照品和輔料適量，按處方制成EPR原位凝膠注射劑的樣品，然后制備高、中、低3種濃度共9份供試品溶液，測定EPR的含量，與加入值進(jìn)行比較，計(jì)算回收率。

1.2.9 樣品含量測定 取不同批次的樣品制成供試品溶液，分別精確量取2 μL，依法測定。

1.2.10 專屬性試驗(yàn) 按處方比例精確稱取EPR

原位凝膠注射劑中除EPR原料藥外的其他成分，同EPR原位凝膠注射劑工藝制備，再按供試品溶液的制備方法處理，即獲得陰性樣品溶液。分別精密吸取乙酰氨基阿維菌素對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各2 μL，按1.2.1中的色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 EPR含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以峰面積(y)對EPR濃度(x)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為y=10 830x+6 492.8，r=0.999 8，進(jìn)樣量在1.562 5 μg/mL～200 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖1和表1)。

圖1 乙酰氨基阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線

序號(hào) №123456789進(jìn)樣量/μg Injection volume11.562 53.1256.2512.52550100200峰面積/(mAU·s-1) Peak area11 09321 09639 81274 689149 003283 500557 1491 068 5652 179 571

2.2 精密度測定

EPR峰面積RSD為1.48%(n=6)，表明儀器精密度符合要求。

2.3 穩(wěn)定性測定

測定液室溫放置24 h，與零時(shí)比較含量無顯著變化，EPR峰面積RSD為0.26%，表明樣品溶液在本試驗(yàn)條件下，至少可以穩(wěn)定24 h。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2。EPR含量的RSD為0.48%，說明此方法重復(fù)性良好。

表2 乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑中乙酰氨基阿維菌素的重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果

2.5 加樣回收率測定

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3，平均回收率為99.61%，RSD為0.47%(n=9)，說明本試驗(yàn)的準(zhǔn)確性高。

2.6 樣品含量測定

3批次EPR原位凝膠注射劑含量測定結(jié)果見表4，測得EPR原位凝膠注射劑的平均含量為5.118%，RSD為0.23%，說明該測定方法準(zhǔn)確、可靠，可用于EPR原位凝膠注射劑中EPR含量的測定。

2.7 專屬性試驗(yàn)

陰性樣品溶液、對照品溶液和供試品溶液的色譜圖見圖2，EPR分離度良好，峰形尖銳，保留時(shí)間5.1～5.2 min，陰性樣品溶液和供試品溶液中的其他組分對EPR的測定無干擾，方法專屬性良好。

表3 乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑中乙酰氨基阿維菌素的加樣回收率測定結(jié)果

表4 乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑中乙酰氨基阿維菌素含量的測定結(jié)果

3 討論

EPR標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)掃描，在240 nm～250 nm的波長處有吸收峰[12]。最初選擇242 nm作為檢測波長，在色譜條件優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇245 nm作為檢測波長時(shí)，檢測的靈敏度顯著提高，故最終將檢測波長定為245 nm。為避免EPR和注射劑中輔料的色譜行為相互干擾，篩選了甲醇-水、乙腈-水、丙二醇-水等流動(dòng)相[13-15]，并根據(jù)色譜分離效果調(diào)整流動(dòng)相組分的體積比，最終確定流動(dòng)相為乙腈∶水∶甲酸(60 mL∶40 mL∶0.04 mL)。在此色譜條件下，EPR與雜質(zhì)分離效果良好，回收率、精密度、穩(wěn)定性等試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了試驗(yàn)所建立的方法專屬性良好。本研究采用HPLC-外標(biāo)法測定EPR原位凝膠注射劑中EPR的含量，方法具有快速簡便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可在EPR原位凝膠注射劑的質(zhì)量控制實(shí)踐中應(yīng)用。

A.陰性樣品；B.對照品；C.供試品

A.Negative sample; B.Eprinomectin standard; C.Tested sample

圖2乙酰氨基阿維菌素原位凝膠注射劑中
乙酰氨基阿維菌素的HPLC色譜圖

Fig.2 HPLC chromatogram of eprinomectin
in situ gel injection