何 建，紀(jì) 鵬，李琛琛，華永麗，姚萬(wàn)玲，魏彥明

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

當(dāng)歸別名岷歸，為傘形科(Umbelliferae)多年生草本植物當(dāng)歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的干燥根，是甘肅省道地藥材，味甘、辛、微苦，性溫，既可扶正補(bǔ)養(yǎng)又可攻邪治病[1-2]，主要功效為補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便，具有極高的藥用和保健價(jià)值[3]，被廣泛用于獸醫(yī)臨床上。其所含成分豐富，包括多糖、阿魏酸、香豆素、揮發(fā)油、黃酮、微量元素等[4]。資料記載，當(dāng)歸多炮制后使用，臨床常用的炮制品有酒當(dāng)歸、土當(dāng)歸、當(dāng)歸炭等[5]。酒當(dāng)歸補(bǔ)血效果最佳，在獸醫(yī)臨床上使用較多，且往往以水煎液的形式使用。為促進(jìn)獸醫(yī)臨床上酒當(dāng)歸補(bǔ)血產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用，篩選酒當(dāng)歸水煎液中最佳補(bǔ)血活性部位具有重要意義。

超聲輔助液液萃取法是基于液-液萃取法并輔以超聲技術(shù)的一種新方法，它主要是用超聲波在超聲過程中產(chǎn)生的一系列效應(yīng)，來(lái)對(duì)萃取過程中的傳質(zhì)作用進(jìn)行加速[6]，最終提高萃取效率。索氏提取是一種液固萃取方法，其用在沸騰時(shí)冷凝下來(lái)的萃取溶劑對(duì)被萃取樣品進(jìn)行反復(fù)萃取[7]。兩者相比，各具優(yōu)點(diǎn)[7]。為篩選酒當(dāng)歸水煎液中較優(yōu)補(bǔ)血活性部位，本試驗(yàn)基于酒當(dāng)歸水煎液中化學(xué)成分極性大小，依據(jù)超聲輔助萃取與索氏提取兩種方法，從酒當(dāng)歸水煎液中分別制備乙酸乙酯部位、正丁醇部位與水部位。通過綜合比較各部位的得率，篩選出最佳制備方案，采用高效液相色譜法對(duì)各部位成分進(jìn)行初步分析，另采用動(dòng)物試驗(yàn)，比較各部位的補(bǔ)血效果，為獸醫(yī)臨床補(bǔ)血藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與主要試劑 當(dāng)歸購(gòu)自甘肅岷縣，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)教研室鑒定為當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels。經(jīng)切制、清洗與曬干后，按《甘肅省中藥炮制規(guī)范》制備成酒當(dāng)歸，存放于實(shí)驗(yàn)室備用。甲醇、乙腈、冰乙酸(均為色譜純)，Sigma公司產(chǎn)品；乙酸乙酯(分析純)、正丁醇(分析純)，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠80只，雌雄各半，體重23 g±2 g，由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證編號(hào) SCXK (甘) 2015-0001)。

1.1.3 主要儀器 1260型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；YP 1102H型分析天平，上海精密科學(xué)有限公司產(chǎn)品；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；玻璃蛇形脂肪提取器，鄭州賽克斯玻璃儀器有限公司產(chǎn)品；BC5300Vet五分類動(dòng)物血液細(xì)胞分析儀，邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 酒當(dāng)歸水煎液樣品的制備 根據(jù)前期單因素結(jié)合響應(yīng)面分析法得到的酒當(dāng)歸水煎液最佳提取條件進(jìn)行酒當(dāng)歸水煎液的制備[8]。共提取3次，3次得到的水煎液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，濃縮至浸膏后置于真空干燥箱中干燥，得到干粉。

1.2.2 酒當(dāng)歸水煎液各極性部位提取

1.2.2.1 超聲輔助萃取法

(1)乙酸乙酯部位：精密稱取酒當(dāng)歸水煎液干粉(過40目篩)10 g，溶于100 mL蒸餾水中，加入100 mL乙酸乙酯，超聲輔助萃取1 h。重復(fù)萃取3次，每次萃取完后置于分液漏斗中靜置1 h，收集上層溶液。合并萃取液，濃縮到一定體積后真空干燥至恒重，所得物質(zhì)即為酒當(dāng)歸水煎液的乙酸乙酯部位。

(2)正丁醇部位：上述乙酸乙酯部位提取后，下層液體置于通風(fēng)櫥中，在微控?cái)?shù)顯電熱板上使其揮發(fā)至無(wú)乙酸乙酯。加入正丁醇100 mL，同樣采用上述超聲輔助萃取3次，合并萃取液體，并濃縮到一定體積后真空干燥至恒重，所得淡黃色干粉物質(zhì)即為酒當(dāng)歸水煎液的正丁醇部位。

(3)水部位：上述正丁醇部位提取后，采用以上操作最終制備出的棕褐色干粉物質(zhì)即為酒當(dāng)歸水煎液的水部位。

1.2.2.2 索氏提取法

(1)乙酸乙酯部位：精密稱取酒當(dāng)歸水煎液干粉(過40目篩)10 g，將其置于脫脂濾紙包內(nèi)，放入玻璃蛇形脂肪提取器中。在圓底燒瓶?jī)?nèi)加入300 mL乙酸乙酯，并置于溫度為85℃的恒溫水浴鍋進(jìn)行回流提取。當(dāng)玻璃蛇形脂肪提取器內(nèi)的乙酸乙酯溶液變成無(wú)色，則終止提取。

(2)正丁醇部位：將乙酸乙酯部位提取完全的濾紙包置于通風(fēng)櫥中使乙酸乙酯殘留物揮發(fā)完全。再采用上述方法，加蒸餾水300 mL，在電熱套中回流提取制備成正丁醇部位。

(3)水部位：將正丁醇部位提取完全的濾紙包置于通風(fēng)櫥中，使正丁醇?xì)埩粑飺]發(fā)完全。再采用上述方法，加蒸餾水300 mL，在電熱套中回流提取制備成水部位。

得率=(不同提取部位平均質(zhì)量÷酒當(dāng)歸水煎液干粉質(zhì)量)×100%

1.2.3 各部位成分分析

1.2.3.1 多糖含量測(cè)定

(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作(苯酚-硫酸法)：精確稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg于100 mL容量瓶，加蒸餾水搖勻、定容，作為母液。分別吸取1、2、3、4、5、6 mL母液于 mL的容量瓶，加蒸餾水定容，得到濃度分別為20、40、60、80、100、120 μg/mL的葡糖糖標(biāo)品溶液。精確吸取1 mL不同濃度的標(biāo)品溶液于干燥的具塞試管中，各試管分別滴加1.8 mL g/L的苯酚溶液，再緩慢加入7.5 mL濃硫酸，充分混勻，密封后沸水浴加熱20 min，待冷卻后測(cè)定吸光度。以相同處理的蒸餾水為空白，于483 nm波長(zhǎng)測(cè)得各濃度的OD值，平行測(cè)定3次，求其平均值，繪制葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)各部位中粗多糖的制備與總糖含量測(cè)定：分別精確稱取1 g酒當(dāng)歸水煎液的3個(gè)部位的干粉于3個(gè)三角瓶中，加入2 mL蒸餾水溶解，然后加入無(wú)水乙醇使其最終含乙醇濃度為65.80%，密封靜置12 h。然后抽濾獲得上層漂浮物。將獲得的漂浮物依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚充分潤(rùn)洗后真空干燥成粉末，即得各部位中的當(dāng)歸粗多糖。精確稱取10 mg的上述粗多糖于 mL的容量瓶中，加入蒸餾水，超聲處理(40 kHz，50℃，30 min)使其完全溶解后定容。按照上述的苯酚-硫酸法測(cè)定樣品的OD值，得到3次平行的平均值。

(3)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密吸取100、150、200、250、300、350、400 μL的果糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 mg/mL)于試管中，分別加入400 μL的DNS顯色劑，定容至5 mL并加試管塞，于沸水浴中加熱5 min，用流水迅速冷卻至室溫振蕩搖勻，室溫放置0.5 h后于510 nm處測(cè)定OD值。

(4)樣品的處理及還原糖的測(cè)定：精確稱取醇沉后的干粉10 mg，定容于10 mL的容量瓶中，吸取400 μL的待測(cè)液按上述DNS法測(cè)定樣品的吸光度值A(chǔ)，得到3次平行的平均值。

多糖含量=總糖含量-還原糖含量。

1.2.3.2 HPLC分析

(1)各極性部位樣品的前處理：分別取各部位樣品0.05 mg，采用70%色譜甲醇定容到10 mL容量瓶中，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液于4℃貯藏備用。

(2)色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；紫外檢測(cè)器。乙酸乙酯部位：流動(dòng)相：1 mL/L冰乙酸A-甲醇B；梯度洗脫，流速：1.0 mL/min；柱溫：28℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm[9]；進(jìn)樣量10 μL；正丁醇部位：流動(dòng)相：8.5 mL/L磷酸A-乙腈B；梯度洗脫，流速1.0 mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：316 nm[10]；進(jìn)樣量10 μL；水部位：流動(dòng)相：0.85%磷酸A-乙腈B；梯度洗脫，流速0.8 L/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：316 nm[10]；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 動(dòng)物分組與造模 試驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)昆明小鼠80只，雌雄各半，體重23 g±2 g，購(gòu)于蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。待適應(yīng)環(huán)境3 d后，將它們隨機(jī)分為8個(gè)組，這些組分別命名為正常對(duì)照組(NC)、模型組(M)、乙酸乙酯部位低、高劑量干預(yù)組(EAL與EAH)，正丁醇部位低、高劑量干預(yù)組(NBL與NBH)，水部位低、高劑量干預(yù)組(WL與WH)。各部位干預(yù)組分別灌胃等量不同部位溶液(10 g/kg)，正常對(duì)照組給予等量蒸餾水，模型組給予同樣體積蒸餾水。于每天早上9點(diǎn)灌胃，每隔24 h灌胃1次，持續(xù)9 d。模型組、各部位干預(yù)組分別于給藥第2日及第5日，給予乙酰苯肼生理鹽水溶液(劑量分別為20 mg/kg與40 mg/kg，皮下注射)，從第5日起，每日給予環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液(40 mg/kg，腹腔注射)，持續(xù)4 d。正常對(duì)照組同時(shí)注射等量生理鹽水。

1.2.5 動(dòng)物一般行為學(xué)觀察 觀察各組小鼠被毛色澤、精神等情況。

1.2.6 取材及檢測(cè) 各組于試驗(yàn)結(jié)束后，麻醉后取血做血常規(guī)檢測(cè)，檢測(cè)各組小鼠全血中的紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(Hb)指標(biāo)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)整理后，計(jì)量資料用mean±SD表示，使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間差異比較采用采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲輔助萃取和索氏提取兩種方法制備酒當(dāng)歸水煎液各極性部位得率

超聲輔助萃取、索氏提取兩種方法制備酒當(dāng)歸水煎液各極性部位得率見表1和表2。超聲輔助萃取制得乙酸乙酯部位得率為0.686%，正丁醇部位得率為6.218%，水部位得率為83.99%。索氏提取制得乙酸乙酯部位得率為0.252%，正丁醇部位得率為3.209%，水部位得率為84.028%。

2.2 酒當(dāng)歸水煎液不同極性部位多糖含量分析

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，可得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，表明吸光度值與葡萄糖濃度在20 μg/mL～140 μg/mL范圍內(nèi)成線性相關(guān)。

y=0.008x+0.127 (R2=0.998 7)

表1 超聲輔助萃取酒當(dāng)歸水煎液各極性部位得率

表2 索氏提取酒當(dāng)歸水煎液各極性部位得率

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，可得果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，表明吸光度值與果糖濃度在20 μg/mL～100 μg/mL范圍內(nèi)線性相關(guān)。

y=0.009x-0.173 (R2=0.999)

圖2 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

酒當(dāng)歸水煎液中乙酸乙酯部位與正丁醇部位未檢出多糖，水部位中1 mg粗多糖中總糖為628.94 μg，還原糖為376.375 μg，所以水部位中1 mg粗多糖中的多糖含量為252.565 μg。

2.3 酒當(dāng)歸水煎液不同極性部位HPLC初步分析

采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)各部位進(jìn)行成分初步分析，乙酸乙酯、正丁醇與水部位的HPLC分析圖譜分別見圖3、圖4和圖5，酒當(dāng)歸乙酸乙酯部位、正丁醇部位與水部位中峰的個(gè)數(shù)與強(qiáng)度具有明顯差異。

圖3 酒當(dāng)歸乙酸乙酯部位的高效液相色譜圖

2.4 酒當(dāng)歸水煎液不同極性部位補(bǔ)血活性分析

2.4.1 臨床觀察 和NC組比較，M組小鼠毛雜亂無(wú)章，沒有光澤，眼睛反應(yīng)不靈敏，動(dòng)作遲鈍緩慢，無(wú)精神，耳朵、尾部沒有血色，喜歡呆在一起。和M組小鼠比較，各部位干預(yù)組的小鼠，有精神，尾巴、耳朵顏色正常，小鼠被毛有一定的光澤、動(dòng)作反應(yīng)敏捷。其中WH組小鼠表現(xiàn)最接近NC組，其次為NBH組。

2.4.2 酒當(dāng)歸水煎液對(duì)血虛小鼠血常規(guī)的影響 小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果見圖6。與正常對(duì)照組相比較，模型組小鼠血液中的RBC、WBC數(shù)目與Hb含量均顯著減少(P<0.05)。與模型組相比，各部位干預(yù)組小鼠血液中的RBC、WBC數(shù)目與Hb含量均顯著升高(P<0.05)。與乙酸乙酯部位高劑量干預(yù)組相比，除WBC指標(biāo)外，水部位高劑量干預(yù)組與正丁醇部位高劑量干預(yù)組小鼠血液中的RBC數(shù)目與Hb含量均顯著升高(P<0.05)。與水部位低劑量干預(yù)組相比較，水部位高劑量干預(yù)組小鼠血液中的RBC、WBC數(shù)目與Hb含量顯著升高(P<0.05)。與正丁醇部位低劑量干預(yù)組相比較，除WBC指標(biāo)外，正丁醇部位高劑量干預(yù)組各指標(biāo)均顯著升高(P<0.05)。說明水部位與正丁醇部位對(duì)血虛小鼠的干預(yù)效果較好，且具有一定的量效關(guān)系。

圖4 酒當(dāng)歸水煎液正丁醇部位的高效液相色譜圖

圖5 酒當(dāng)歸水煎液水部位的高效液相色譜圖

3 討論

中獸醫(yī)學(xué)對(duì)保障我國(guó)畜牧業(yè)健康發(fā)展發(fā)揮了重要作用，長(zhǎng)期以來(lái)用于預(yù)防和治療畜禽疾病，具有效果確實(shí)、毒副作用小和不易形成耐藥性、確保動(dòng)物性食品安全等優(yōu)點(diǎn)，符合現(xiàn)代畜牧業(yè)綠色發(fā)展的需求。從動(dòng)物價(jià)值與福利來(lái)考慮，畜禽發(fā)生血虛對(duì)其生產(chǎn)性能影響很大[11]。血虛主要是由氣血生化不足和失血過多兩方面引起，中獸醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為“虛則補(bǔ)之”，因此治療動(dòng)物血虛重在養(yǎng)血補(bǔ)血。當(dāng)歸為甘肅道地藥材，對(duì)畜禽有顯著補(bǔ)血效果[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸中主要補(bǔ)血成分為當(dāng)歸多糖[13]。當(dāng)歸炮制方法常包括油炒、酒炒、土炒與炒炭[14]。當(dāng)歸經(jīng)炮制后，所含的主要活性成分會(huì)發(fā)生顯著變化[15-16]，其藥效也隨之發(fā)生顯著變化[17]，且有資料顯示當(dāng)歸酒炙后補(bǔ)血效果顯著增強(qiáng)[18]。中藥水煎液形式為目前臨床常見劑型，吸收快且療效佳，但是其也存在一定的弊端，如給藥比較困難、藥物容易浪費(fèi)等。因此，基于化學(xué)與動(dòng)物試驗(yàn)相結(jié)合的方法，嘗試分離篩選出酒當(dāng)歸水煎液中有效補(bǔ)血成分具有一定的臨床價(jià)值。

字母不同表示差異顯著(P<0.05) The different letters denote significant difference (P<0.05)

本研究通過比較對(duì)酒當(dāng)歸水煎液進(jìn)行分離提取各極性部位的兩種方法，結(jié)果顯示超聲輔助萃取所得乙酸乙酯、正丁醇部位約為索氏提取量的3倍，證實(shí)應(yīng)用超聲輔助技術(shù)來(lái)強(qiáng)化提取過程，可有效提高提取效率，節(jié)約成本，經(jīng)分析原因可能是酒當(dāng)歸水煎液浸膏所得干粉含糖量較高、易結(jié)塊，導(dǎo)致索氏提取法未能充分提取，而超聲輔助萃取技術(shù)更加適于分離提取酒當(dāng)歸水煎液各部位，這與以往報(bào)道相符[19]。

為篩選酒當(dāng)歸最佳補(bǔ)血部位，以乙酰苯肼與環(huán)磷酸酰胺聯(lián)合復(fù)制小鼠血虛動(dòng)物模型，血液紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量顯著下降，表明小鼠血虛模型建立成功，而不同極性部位的酒當(dāng)歸水煎液對(duì)乙酰苯肼與環(huán)磷酰胺引起的血虛模型，具有明顯升高紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量的作用以發(fā)揮對(duì)血虛模型小鼠的治療作用，其中以水部位(劑量1.24 g/mL)與正丁醇部位(劑量0.1 g/mL)對(duì)血虛的治療效果較好。

多糖成分檢測(cè)與HPLC-UV分析比較各部位成分，發(fā)現(xiàn)酒當(dāng)歸水煎液中乙酸乙酯部位與正丁醇部位未檢出多糖，水部位中1 mg粗多糖中總糖為628.94 μg，還原糖為376.375 μg，表明水部位中1 mg粗多糖中的多糖含量為252.565 μg。HPLC-UV分析，顯示酒當(dāng)歸乙酸乙酯部位、正丁醇部位與水部位中峰個(gè)數(shù)與強(qiáng)度具有明顯差異。其中乙酸乙酯部位的檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，正丁醇和水部位的均為316 nm，查閱文獻(xiàn)[9-10]，并結(jié)合摸索液相分析條件發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯部位在280 nm處，可以檢測(cè)出較多種類物質(zhì)，而正丁醇和水部位均在316 nm可以檢測(cè)出較多種類物質(zhì)。不同部位峰個(gè)數(shù)與強(qiáng)度差異較大，經(jīng)分析原因可能是3個(gè)部位因極性的不同，造成各部位成分出現(xiàn)多樣性差異。正丁醇部位與水部位補(bǔ)血效果較好，可以推測(cè)這2個(gè)部位所含的補(bǔ)血成分含量較高，可為后續(xù)補(bǔ)血部位成分的深入研究奠定基礎(chǔ)，并為開發(fā)獸醫(yī)臨床當(dāng)歸補(bǔ)血藥物提供依據(jù)。