吳苑瀅，宋漫玲，陳燕晴，何 穎，段群棚，林昌華，蔣家霞，張 寧，郭 旋，胡庭俊*

(1．廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧 530001；3.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團新興有限公司，廣西柳州 545112 ；4.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團金光有限公司，廣西南寧 530022)

魚腥草是一種“藥食兩用”的植物，性味寒辛，可清熱解毒、利尿、消腫排膿[1]。魚腥草含有揮發(fā)油、有機酸、生物堿、維生素等多種有效成分，能夠消炎、抗菌、抗病毒，具有明顯促進白細胞和巨噬細胞的吞噬功能而增強機體的免疫力[2-4]。本試驗所用的魚腥草桔苓合劑主要由魚腥草、桔梗、陳皮、茯苓等中草藥組成，中醫(yī)認為桔梗歸肺經(jīng)而用于宣肺平喘、排膿祛痰，劉琴等[5]復(fù)制大鼠肺纖維化模型結(jié)果提示，桔梗皂苷D具有抗肺纖維化作用，于維穎等[6]建立哮喘豚鼠模型發(fā)現(xiàn)桔梗水提物對呼吸道感染誘發(fā)的支氣管哮喘有一定作用。茯苓入心、脾、腎經(jīng)，滲濕利尿，和胃健脾[7]。陳皮理氣健脾，燥濕化痰[8]。因此，魚腥草桔苓合劑主要功效為清肺平喘、止咳祛痰。本試驗旨在對魚腥草桔苓合劑進行長期毒性試驗觀察，在安全性方面為獸醫(yī)臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥物 魚腥草桔苓合劑(中試產(chǎn)品，生產(chǎn)批號1509041)，規(guī)格為每1 mL相當(dāng)于原生藥1.025 g，100 mL/瓶，徐州天意動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，有效期2年。

1.1.2 儀器及試劑 Aida TD-5A臺式低速離心機、純水儀(CD-UPT-1)，成都純越科技有限公司產(chǎn)品；AB104-L分析天平，瑞士梅特勒公司產(chǎn)品；UV-1800型紫外可見光分光光度計，北京瑞利分析儀器公司產(chǎn)品；尼康YS100生物顯微鏡；日本Hitachi-7180全自動生化分析儀，配套試劑為美康生物科技公司；日本Sysmex-2100全自動血液分析儀及其配套試劑等。

1.1.3 實驗動物 SPF級SD大鼠，體重90 g～120 g，80只，雌雄各半，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2014-0002；飼料為鼠全價飼料，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；飼養(yǎng)條件為室溫22℃～27℃，相對濕度40%～75%。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組與處理 試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d～5 d，將80只大鼠隨機分為4組，即空白對照組、高劑量組(50 mL/kg)、中劑量組(25 mL/kg)和低劑量組(12.5 mL/kg)，每組20只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。按每只大鼠20 mL/d飲水量，將藥物混入飲水中，連續(xù)用藥30 d。給藥結(jié)束后，每組隨機取雌雄大鼠各5只，眼眶取血，進行血液學(xué)檢查；分離血清，進行血液生化學(xué)檢查，主要器官用100 mL/L中性福爾馬林固定,用于組織病理學(xué)檢查。各組剩余動物停止給藥，繼續(xù)飼養(yǎng)觀察7 d，再進行剖檢。

1.2.2 檢測指標 每天觀察大鼠的一般健康狀況，包括活動、采食、飲水、發(fā)病和死亡情況；按每7 d測定大鼠體重1次。用藥后30 d及停藥后7 d，各組分別隨機選大鼠10只，雌雄各半，稱重、眼眶采血后頸椎脫臼處死，剖檢，采集心、肝、脾、肺、腎、胃、睪丸、卵巢子宮稱重，并用100 mL/L中性福爾馬林固定。先對高劑量組和對照組大鼠的主要臟器進行組織病理學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量組大鼠的相應(yīng)器官及組織進行檢查。各組雌雄大鼠各5只采血進行血液學(xué)和血液生化指標測定，包括血紅蛋白、紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞的分類計數(shù)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素(UN)、肌酐(CRE)、血糖(GLU)、白蛋白(ALB)、總蛋白(T-PRO)、總膽固醇(TCH)和甘油三酯(TG)含量。30 d飼喂后于試驗結(jié)束時測定1次，停藥7 d后測定1次。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件比較均值-單因素方差分析和多重比較，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

給藥30 d期間，各組的大鼠精神、行為、活動、毛色、排糞、排尿等一般體征均未見異常，毛色白且有光澤。高劑量組雄性大鼠有1只死亡，死亡前臨床癥狀表現(xiàn)為尾巴出現(xiàn)少量傷口，毛發(fā)稍色暗、粗硬。其他大鼠的各項體征均未見異常。

2.2 增重

各給藥組，給藥30 d后與停藥7 d內(nèi)的平均體重的增長趨勢基本相似，與空白對照組比較，第14天至第30天低劑量組的體重增長趨勢較為平緩，停藥后7 d，各劑量組與空白對照組比較無顯著差異(P>0．05)，表明長期給藥對大鼠體重?zé)o不良影響(圖1)。

圖1 魚腥草桔苓合劑對大鼠30 d的平均增重的影響

2.3 血液學(xué)指標

給藥30 d，各給藥組所有血液學(xué)指標分別與同期空白對照組比較均無顯著差異(P>0.05)；停止給藥后7 d恢復(fù)期，各給藥組的多數(shù)指標與空白對照組比較無顯著差異(P>0.05)，高劑量組的白細胞、淋巴細胞、單核細胞與空白對照組有顯著差異(P<0.05)，說明本品中劑量和低劑量對大鼠血液學(xué)指標無顯著不良影響(表1和表2)。

2.4 血液生化指標

給藥30 d及停藥7 d后，各給藥組中多數(shù)SD大鼠的血液生化指標分別與同期空白對照組比較均無顯著差異(P>0.05)。給藥30 d后，中劑量組SD大鼠血清中的白蛋白含量顯著低于空白對照組(P<0.05)；停藥7 d后，高劑量組SD大鼠血清中的白蛋白含量顯著低于空白對照組(P<0.05)(表3和表4)。

表1 魚腥草桔苓合劑用藥30 d后大鼠的血液學(xué)指標

2.5 臟器指數(shù)

給藥30 d及停藥7 d后，各給藥組中多數(shù)SD大鼠的臟器指數(shù)分別與同期空白對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。給藥30 d后，低劑量組SD大鼠的脾臟臟器指數(shù)極顯著高于空白對照組(P<0.01)，低劑量組SD大鼠的肺的臟器指數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)；停止給藥后7 d，各個劑量組SD大鼠的各臟器指數(shù)指標與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)(表5和表6)。

表2 魚腥草桔苓合劑停藥后7 d大鼠的血液學(xué)指標

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

Note：Compared with blank control group，*P<0.05.

表3 魚腥草桔苓合劑用藥后30 d大鼠的血清生化指標

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

Note：Compared with blank control group，*P<0.05.

表4 魚腥草桔苓合劑停藥后7d大鼠的血清生化指標

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

Note：Compared with blank control group，*P<0.05.

表5 魚腥草桔苓合劑用藥后30 d大鼠的臟器指數(shù)

注：與空白對照組比較，*P<0.05,**P<0.01。

Note：Compared with blank control group，*P<0.05,**P<0.01.

表6 魚腥草桔苓合劑停藥后7 d大鼠的臟器指數(shù)

2.6 病理組織學(xué)檢查

30 d給藥期間高劑量組死亡大鼠剖檢可見肺臟色蒼白、有大理石樣花紋，肝稍腫大。停止給藥后，大鼠處死，立即剖檢，肉眼逐個觀察各臟器，低劑量組1只大鼠脾臟稍腫大；高劑量組個別大鼠肝臟有一白色綠豆大的結(jié)節(jié)。各組的其他器官無肉眼可見病變。停藥7 d恢復(fù)期內(nèi)，高劑量組雄性大鼠死亡1只，經(jīng)剖檢觀察，其肺部與背部黏連，肺外觀紅白相間似大理石樣花紋，部分肺葉邊緣質(zhì)地較硬，其他臟器無肉眼可見病變；停藥7 d后剖檢，高劑量組SD大鼠剖檢有個別肝臟見白色小結(jié)節(jié)；其他臟器均無肉眼可見的病變。

器官切片鏡檢，高劑量組死亡SD大鼠的肺部充滿較多的血細胞，肺組織結(jié)構(gòu)不清晰，肺泡壁增厚；30 d后的SD大鼠臟器在低倍鏡和高倍鏡下觀察，空白對照組的肺臟結(jié)構(gòu)較完整，低、中、高劑量組的少量肺部切片可見肺泡結(jié)構(gòu)不完整且管腔有紅細胞細胞浸潤、有纖維組織填充在部分肺泡腔里；高劑量組SD大鼠的肝組織切片觀察到肝小葉、肝索不清晰，但細胞無明顯病變，其他臟器無明顯病理變化(圖2和圖3)。

3 討論

長期毒性即為實驗動物在持續(xù)多天里接觸較大劑量的外來化合物然后引起的中毒效應(yīng)，是用于驗證在長期持續(xù)用藥的情況下，藥物對用藥機體所產(chǎn)生的毒性大小和損害機體的嚴重程度，還有對機體主要毒性靶器官的影響，為臨床用藥的劑量要求和主要觀察指標提供一定的科學(xué)參考[9-10]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》中關(guān)于新獸藥的安全性評價的技術(shù)要求，在獲得藥物的急性毒性相關(guān)資料后，還要進行大鼠30 d喂養(yǎng)試驗，觀察試驗組大鼠的各項生理生化指標，以檢驗該藥物臨床使用的安全性。血液生化指標的檢測是用于評判肝腎等重要臟器功能是否正常的客觀而又靈敏的指標，有時由于溶血，血清中某些指標如AST、LDH、ALP的測定值會顯著高于機體真實值，而某些指標的測定值如血糖、胰島素、總蛋白等會明顯低于機體真實值[11]；不同的采血方式也會對血常規(guī)和血糖值產(chǎn)生影響[12]，據(jù)研究表明靜脈血結(jié)果比較穩(wěn)定且準確[13]。

圖2 給藥30 d后雄性大鼠部分組織切片(HE，400×)

本試驗使用的魚腥草桔苓合劑，主要由魚腥草、桔梗、陳皮、茯苓等中草藥組成，依據(jù)清肺化痰，止咳平喘，提高機體非特異性和特異性免疫功能的治療原則來辨證組方。這些單方藥物在《本草》、《別目》、《本草綱目》等文獻中均未見有毒性記載，選取的藥物安全可靠。本試驗將魚腥草桔苓合劑按高、中、低劑量組50、25、12.5 mL/kg體重對SD大鼠連續(xù)30 d進行給藥，各劑量組的SD大鼠臨床表現(xiàn)良好，未出現(xiàn)可疑中毒癥狀和毒副作用的相關(guān)不良反應(yīng)，且各劑量組SD大鼠的體重、血液學(xué)指標、血液生化指標、臟器指數(shù)等各項指標與對照組相比均無顯著差異；病理組織學(xué)檢查各劑量組SD大鼠的心、肝、脾、腎、睪丸(卵巢)等主要靶器官，均未見與藥物毒性相關(guān)的顯著病變；并且在對SD大鼠連續(xù)給藥30 d、停藥7 d后，亦未出現(xiàn)遲發(fā)性不良反應(yīng)。綜上試驗結(jié)果表明，按臨床擬用劑量服用魚腥草桔苓合劑是安全的。

圖3 給藥30 d后雌性大鼠部分組織切片(HE，400×)

給藥期間死亡的1只SD大鼠臨床表現(xiàn)為口角和尾巴出現(xiàn)傷口，毛發(fā)臟亂、粗硬；由于雄性大鼠的精神狀態(tài)相對興奮，傷口可能是互相打架而抓傷較弱小的大鼠；病理剖檢只見其肺部稍腫大，色白，與背部黏連；病理切片檢查發(fā)現(xiàn)肺間隙中僅有少量紅細胞充斥在肺泡腔內(nèi)，其他臟器均為無明顯病變。給藥結(jié)束后，各劑量組的SD大鼠出現(xiàn)個別肺部有類似病變，但該長期毒性試驗的靶器官主要為心、肝、腎、脾、胃和睪丸(卵巢)等臟器，并且經(jīng)臨床診斷和病理組織切片檢查發(fā)現(xiàn)，高、中、低劑量組SD大鼠的心、肝、腎、脾、胃和睪丸(卵巢)等臟器組織與空白對照組相比，基本無明顯可見病變。由此推測，該死亡SD大鼠的肺部病變不是由于試驗藥物毒性引起的，其死亡原因還有待進一步查明。