馬建青，吳占勇，孔建軍，王會旺，趙朝暉，王 祺

(冀中能源邢臺礦業(yè)集團(tuán)總醫(yī)院動物實驗室，河北邢臺 054000)

椎間盤組織是脊柱的重要組成結(jié)構(gòu)之一，它以基質(zhì)為主要結(jié)構(gòu)，細(xì)胞散在分布于基質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)而存在。研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤基質(zhì)內(nèi)最主要的蛋白質(zhì)是蛋白聚糖和膠原，它們維持著基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的完整性[1]。聚集蛋白聚糖(aggrecan)是椎間盤蛋白聚糖中最主要的一種。

近年來一系列的研究認(rèn)為，遺傳因素尤其是退變基因的多態(tài)性在椎間盤退變過程中也發(fā)揮著巨大作用[2-3]。Doege K J等[4]在1997年發(fā)現(xiàn)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)中aggrecan的變化在退變性椎間盤疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，并提出歐洲人群中編碼Aggrecan的第12個外顯子的基因序列存在可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeats,VNTR)多態(tài)性。譚平先等[5]以133例中國南方地區(qū)漢族人群Aggrecan核心蛋白基因片段為樣本，研究發(fā)現(xiàn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性，主要以中等長度串聯(lián)重復(fù)序列出現(xiàn)頻率最高。椎間盤退變的動物實驗研究方面，謝林等[6]以波爾多山羊(Bordeaux goat)為研究對象，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測了腰椎間盤髓核組織中缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、核因轉(zhuǎn)錄子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)在退變模型實驗組和正常山羊?qū)φ战M的表達(dá)量差異顯著。Li IMH等[7]通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型和轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了4種與aggrecan基因表達(dá)相關(guān)的增強子，并證明聚集蛋白聚糖基因在軟骨形成中具有時間和空間的表達(dá)差異。由此可見，從分子生物學(xué)角度研究椎間盤退變相關(guān)基因多態(tài)性對揭示退變性椎間盤疾病的發(fā)病機(jī)制、治療及預(yù)防有重要意義。目前，國內(nèi)外對aggrecan基因在動物體內(nèi)多態(tài)性和遺傳分化研究已逐漸深入，而本研究用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)的方法研究不同物種種間和物種內(nèi)aggrecan基因編碼區(qū)的相關(guān)特征及所編碼蛋白的理化性質(zhì)、信號肽和二級結(jié)構(gòu)等，旨在探明該基因在所研究物種種間和種內(nèi)的遺傳分化及所編碼蛋白特性，進(jìn)而為開展相關(guān)動物試驗、建立脊柱退變動物模型研究提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 序列來源

所需基因序列從NCBI網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的GenBank中下載，本研究中分別下載了人、獼猴、白頂白眉猴、牛、家犬、野豬、羊駝、綿羊、雪貂、褐家鼠、小家鼠、灰倉鼠和原雞共13個物種的50條aggrecan基因編碼區(qū)序列(表1)。

1.2 方法

用生物學(xué)軟件BioEdit對已下載的50條不同物種aggrecan的基因編碼區(qū)序列進(jìn)行比對分析，選取、編輯共有的編碼區(qū)序列(長度為5 497 bp)進(jìn)行比較，再用 DnaSP5.10軟件對其進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，并生成單倍型，在此基礎(chǔ)上計算種間核苷酸歧異度(nucleotide differences,Dxy)與遺傳分化系數(shù)(genetic differentiation coefficient,Gst)。用軟件MEGA5.0的UPGMA方法進(jìn)行種間聚類分析，構(gòu)建出所研究物種aggrecan基因的聚類圖。分別用在線軟件工具ProtParam，SignalP 4.1 Server和PBIL PRABI Lyon Gerland 信息庫分析所研究物種aggrecan核心蛋白氨基酸序列的理化性質(zhì)，并對氨基酸序列信號肽和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

表1 不同物種aggrecan基因序列來源

2 結(jié)果

2.1 不同物種aggrecan基因核苷酸序列特征

2.1.1 不同物種aggrecan多態(tài)位點、單倍型及其多樣性 不同物種aggrecan基因共50條序列(長度為5 497 bp)中，共發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點3 081個，占所研究基因位點的百分率約為56.0%，其中包含88個單一多態(tài)位點，占所研究基因位點的百分率約為1.6%；共發(fā)現(xiàn)單倍型22種(表2)。分析顯示,核苷酸多樣性值為0.016 4，其中雪貂aggrecan基因多態(tài)位點數(shù)明顯高于其他物種，小家鼠aggrecan基因單倍型多樣性和核苷酸多樣性值較其他物種的值高。

2.1.2 不同物種aggrecan基因遺傳分化 所研究的各物種種群間核苷酸歧異度為0.037 5～0.427 9，遺傳分化系數(shù)為0.000 0～1.000 0(表3)，由數(shù)據(jù)可看出，不同物種間核苷酸歧異度和遺傳分化系數(shù)的變化范圍均較大。依據(jù)物種間的核苷酸歧異度構(gòu)建的分子聚類圖可看出，人與獼猴、牛與野豬、家犬與雪貂、小家鼠與褐家鼠的親緣關(guān)系分別較近，雖然灰倉鼠與小家鼠、褐家鼠在聚類圖中距離稍遠(yuǎn)，但是它們來源于同一支，所以三者親緣關(guān)系亦較近，而原雞與所研究其他物種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖1) 。

2.2 氨基酸序列特征

2.2.1 aggrecan核心蛋白氨基酸序列及理化性質(zhì)分析 所研究物種的aggrecan核心蛋白氨基酸序列及理化性質(zhì)用在線軟件工具ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)進(jìn)行分析(表4)。結(jié)果表明，來自13個物種aggrecan核心蛋白氨基酸序列親水性值為0.254～0.391，分子質(zhì)量為221 311.90 ku～250 372.17 ku，理論等電點為4.01～4.26，不穩(wěn)定系數(shù)為44.59～53.92。

表2 不同物種aggrecan基因序列多態(tài)信息、單倍型及其多樣性

表3 不同物種aggrecan基因核苷酸歧異度和遺傳分化

注：左三角為核苷酸歧異度；右三角為遺傳分化系數(shù)。

Note:The left triangle indicates nucleotide differences; The right triangle indicates genetic differentiation.

圖1 根據(jù)物種間aggrecan核苷酸歧異度構(gòu)建的聚類圖

2.2.2 信號肽預(yù)測 信號肽通常位于蛋白質(zhì)的N末端，用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移和定位，是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈。因此，信號肽的預(yù)測可初步判斷所研究蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白[8]。用在線軟件SignalP 4.1Server 分別對13個物種的aggrecan核心蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所研究物種的氨基酸序列的C值、S值和Y值在信號肽區(qū)域均較高，提示序列中含有信號肽，該蛋白為分泌蛋白(圖2)。同時發(fā)現(xiàn)，所預(yù)測的13個物種aggrecan核心蛋白氨基酸序列的信號肽裂解位點不一致，除小家鼠、雪貂和原雞的aggrecan核心蛋白的信號肽在第19～21個氨基酸位置裂解外，其余10個物種的aggrecan核心蛋白的信號肽在第16～17個氨基酸所在位置裂解(表4)。

A.人aggrecan核心蛋白信號肽裂解位點在第16～17個氨基酸位置；B.原雞aggrecan核心蛋白信號肽裂解位點在第20～21個氨基酸位置

A.Homosapienssignal peptide hydrolysis site of aggrecan core protein between 16-17 amino acid; B.Gallusgallussignal peptide hydrolysis site of aggrecan core protein between 20-21 amino acid

圖2 信號肽預(yù)測

注：表中第十列“信號肽裂解位點”中阿拉伯?dāng)?shù)字代表氨基酸序列位置。

Note:The Arabic numerals indicate the position of amino acid sequence of the tenth column “signal peptide hydrolysis site” in table.

2.2.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)作為生物體內(nèi)重要的高分子之一，對于機(jī)體正常功能的維持至關(guān)重要。蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)與其功能和它們在生物體內(nèi)發(fā)揮的作用密切相關(guān)。因此，對于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究重點。本研究用PBIL PRABI Lyon Gerland 信息庫對不同物種aggrecan核心蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白主要以無規(guī)則卷曲、延伸主鏈和α-螺旋形式存在，其中無規(guī)則卷曲所占比例為59.84%～69.14%，其次是延伸主鏈，所占比例為23.56%～30.06%，α-螺旋所占比例為5.70%～10.10%(表4)，未發(fā)現(xiàn)其他二級結(jié)構(gòu)。

2.2.4 不同物種aggrecan基因密碼子偏愛性 用DnaSP5.10軟件計算所研究各物種aggrecan基因序列編碼區(qū)中密碼子有效值(effective number of codons,ENC)為55.736(<61)， 偏愛指標(biāo)(codon Bias Index,CBI)值為0.199，在零值以上，經(jīng)χ2檢驗，計算得到未校正的χ2值為0.128。上述數(shù)值說明aggrecan基因?qū)γ艽a子有較強的偏愛性[9]。

2.2.5 不同物種aggrecan基因的同義替換和非同義替換 不同物種的50條aggrecan基因序列編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)1 354.54個同義替換平均位點數(shù)，3 886.46個非同義替換平均位點數(shù)。研究顯示同義替換位點數(shù)范圍為1 277.33～1 383.67，同義替換核苷酸多樣性均值為0.195 59；非同義替換位點數(shù)范圍為3 862.22～3 963.67，非同義替換核苷酸多樣性均值為0.152 45。由數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，所研究物種aggrecan基因的非同義替換位點數(shù)均明顯高于同義替換位點數(shù)。

3 討論

3.1 不同物種aggrecan基因核苷酸特征分析

從所研究物種aggrecan基因序列多態(tài)性信息、單倍型及其多樣性數(shù)據(jù)得出各物種的遺傳相關(guān)參數(shù)(多態(tài)位點數(shù)、單倍型多樣性等)存在差異，表明aggrecan基因在種群間存在遺傳變異，aggrecan基因序列編碼區(qū)在種內(nèi)表現(xiàn)相對保守，種間則表現(xiàn)有較豐富的遺傳多樣性，數(shù)據(jù)顯示出aggrecan基因在一些物種間，如人與獼猴、白頂白眉猴，家犬、褐家鼠與灰倉鼠之間比較保守。雪貂與野豬aggrecan基因多態(tài)位點數(shù)值較高，小家鼠aggrecan基因多態(tài)位點數(shù)值亦相對較高，同時其單倍型多樣性值和核苷酸多樣性值在所研究物種中最高，說明上述3個物種的aggrecan基因存在較豐富的遺傳多樣性。

表3數(shù)據(jù)顯示，不同物種間aggrecan基因核苷酸歧異度和遺傳分化系數(shù)的變化范圍均較大，說明不同物種間aggrecan基因遺傳分化較為明顯。其中人和獼猴，牛和野豬，家犬和雪貂，灰倉鼠和小家鼠、褐家鼠等4組物種兩兩比較，它們之間核苷酸歧異度最小，表明其親緣關(guān)系較近。同時表3數(shù)據(jù)和聚類圖顯示出小家鼠和褐家鼠親緣關(guān)系較灰倉鼠的更近。通過分析數(shù)據(jù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，原雞與其他物種的aggrecan基因核苷酸歧異度最大，說明原雞與其他物種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，上述結(jié)果與動物分類學(xué)相一致。

3.2 不同物種aggrecan氨基酸特征分析

本研究結(jié)果顯示，聚集蛋白聚糖多肽鏈表現(xiàn)為親水性，理論等電點數(shù)值均小于7，說明該多肽鏈為酸性。多肽鏈的不穩(wěn)定系數(shù)為44.59～53.92，說明aggrecan多肽不穩(wěn)定。分析13個物種的aggrecan核心蛋白氨基酸序列C值、S值和Y值在信號肽區(qū)域均較高，表明該蛋白屬于分泌蛋白。雖然所研究的大多數(shù)物種的aggrecan信號肽裂解位點在第16-17個氨基酸位置，但是有部分物種aggrecan的信號肽裂解位點存在差異，說明聚集蛋白聚糖基因存在不同程度的遺傳分化。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成為無規(guī)則卷曲、延伸主鏈和α-螺旋，其中無規(guī)則卷曲所占比例最高，未發(fā)現(xiàn)其他二級結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)在翻譯過程中，物種間或物種內(nèi)的不同基因在密碼子的使用上一般都具有明顯的偏愛性[10]。本研究也得出aggrecan基因?qū)γ艽a子具有較強的偏愛性。蛋白質(zhì)在翻譯過程中某些堿基會發(fā)生一定程度的替換，包括同義替換和非同義替換。同義替換現(xiàn)象的發(fā)生大多不受自然選擇的控制，同義替換速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非同義替換速率，且這種現(xiàn)象發(fā)生的速率與基因密切相關(guān)，這被認(rèn)為是凈化選擇的結(jié)果[11]。而在某些基因中，非同義替換速率則遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同義替換速率，原因在于達(dá)爾文的正向選擇[12]。本研究結(jié)果表明，所選物種aggrecan基因的非同義替換位點數(shù)均明顯高于同義替換位點數(shù)，由此說明，所研究的物種在進(jìn)化過程中很大程度上可能受到達(dá)爾文正向選擇的影響。

在脊柱退變的動物建模方面，主要有自發(fā)退變模型[13-15]、損傷動物模型[16-18]、誘導(dǎo)退變模型等[19-21]，大動物模型和小動物模型都有研究，常見的動物種類有嚙齒類大鼠、兔、犬、豬、牛、羊等。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)的不同物種間和物種內(nèi)aggrecan基因編碼區(qū)的相關(guān)特征及所編碼蛋白的理化性質(zhì)、信號肽和二級結(jié)構(gòu)等，闡明了該基因在所研究物種種內(nèi)和種間的遺傳分化及所編碼的蛋白特性，進(jìn)而為開展相關(guān)動物試驗、建立脊柱退變動物模型研究提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)資料。對于椎間盤退變基因以及所編碼蛋白的差異表達(dá)與椎間盤退變的發(fā)病關(guān)聯(lián)性有待進(jìn)一步研究。