紀 雪，邢新月，梁 冰，王詩雨，祝令偉，劉 軍，郭學軍，孫詩雯，孫 洋

(軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，吉林長春 130122)

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，形成了多品種、集約式的高壓力養(yǎng)殖模式。這種模式在很大程度上導致了魚類疾病的增加，其中細菌感染性疾病最為多見[1]。為了防控細菌感染，抗菌藥物被大量應用于淡水養(yǎng)殖業(yè)，隨之而來的就是細菌耐藥性的日益嚴重。一方面導致細菌病防控難度的增加，同時也對環(huán)境和人類健康帶來潛在的危害[2-4]。淡水魚腸道中攜帶的主要菌群為哈夫尼亞菌屬、氣單胞菌屬、檸檬酸菌屬、芽胞桿菌屬和鏈球菌屬等菌群[5]，埃希菌菌屬相對不占優(yōu)勢，但在魚生病后，大腸埃希菌作為條件致病菌可嚴重危害病魚。國內外對大腸埃希菌的研究多見于人及禽畜等養(yǎng)殖動物等，對淡水魚類攜帶大腸埃希菌的研究較少。

大腸埃希菌為革蘭陰性桿菌，多為溫血動物腸道正常菌群的組成部分，但其容易獲得外源毒力因子及耐藥相關遺傳元件而衍化為病原菌并變得難以治療[6]。當環(huán)境質量下降、寄居部位改變、機體免疫機能下降或菌群失調，都可能會引起大腸埃希菌的感染發(fā)病。本研究對長春地區(qū)淡水養(yǎng)殖魚類攜帶大腸埃希菌的耐藥及毒力開展研究，為淡水魚的臨床用藥提供科學依據(jù)，同時也為淡水魚攜帶的致病性大腸埃希菌及其耐藥性產(chǎn)生的公共衛(wèi)生風險評估提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 自2014年10月至2016年1月，采集自長春市周邊養(yǎng)魚場及水產(chǎn)市場淡水魚共計322條。其中健康魚樣品 243條，病魚樣品79條。

1.1.2 菌株和培養(yǎng)基 大腸埃希菌CVCC208、CVCC215、CVCC216、CVCC239，購自中國獸藥監(jiān)察所菌種保藏中心；大腸埃希菌EHECO157:H7和大腸埃希菌ATCC25922，軍事獸醫(yī)研究所細菌學研究室保存；LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、腦心肉湯培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，青島海博公司產(chǎn)品；CHROMagar尿道定位顯色培養(yǎng)基，法國科瑪嘉公司產(chǎn)品；MH瓊脂，法國梅里埃公司產(chǎn)品；MH液體培養(yǎng)基，索來寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器和試劑 EDC-810型PCR擴增儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品；BD PhoenixTM-100 System細菌鑒定系統(tǒng)，美國BD公司產(chǎn)品；2×TaqMasterMix試劑包、細菌基因組提取試劑盒，康為世紀公司產(chǎn)品；DNA分子量標準DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；致瀉性大腸埃希菌O抗原診斷血清，天津生物芯片有限公司產(chǎn)品；引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離和鑒定 無菌操作取魚腸道內容物于4 mL離心管內，加入2 mL生理鹽水，充分振蕩混勻。上清在尿道定位顯色培養(yǎng)基平板劃線，36℃±1℃培養(yǎng)16 h～18 h，挑取典型單菌落在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進行純化，純化后單菌落保菌，并用Phoenix100全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行生化鑒定。每份樣品保留1株。

1.2.2 大腸埃希菌特異性PCR鑒定 根據(jù)文獻[7]，用大腸埃希菌16S rDNA 特異性引物，對分離株進行PCR鑒定，引物序列F:5′-TGTGGGAACGGCGAGTCGGAATAC-3′；R:5′-GGGCGCAGGGGATGAAACTCAAC-3′。PCR反應體系(25 μL)：2×PCR Master Mix酶12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應條件：95℃10 min；94℃ 40 s，60℃ 40 s， 72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃ 7 min。

1.2.3 生化和藥敏試驗 用Phoenix100全自動微生物鑒定系統(tǒng)對分離的大腸埃希菌進行生化鑒定和耐藥譜檢測。

1.2.4 耐藥基因檢測 參照文獻[8]，并根據(jù)國內流行的四環(huán)素耐藥基因類型，用PCR對36株分離株進行6種四環(huán)素耐藥基因的檢測。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃ 1min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時依據(jù)文獻[9]，對13株ESBLs表型大腸埃希菌進行blaCTX-M、blaTEM和blaSHV共3種耐藥基因進行PCR擴增。blaCTX-M基因陽性菌株再用多重PCR進一步分群。

1.2.5 系統(tǒng)進化分群 參照文獻[9]，用多重PCR對大腸埃希菌分離株進行系統(tǒng)進化分群。PCR反應體系(25 μL)：12.5 μL 2×PCR Master Mix酶，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

《夜》劇中第一次出現(xiàn)中國元素就是中國佬廚師。那個廚師在整部劇中沒有一句臺詞，仿佛是個隱形人，但他卻側面推動了情節(jié)的發(fā)展。導游香農(nóng)為了讓那幫女游客下車，讓餐館老板瑪克辛提供給他一份含有中國菜的菜單，用中國菜、中國廚師和來自中國上海等獨特的中國元素來吸引她們?！爸袊袕N師”、“上海人”、“來自特設俱樂部”、“鉆研大陸烹飪技術”和“牛肉雜燴和各種熱炒都會做”（1982:409）等字眼中給人的印象是一個地道的高級中國廚師，也讓我們看到中國熱炒的魅力。當然，這些中國元素也間接折射了二戰(zhàn)前后華人在美國的生存狀態(tài)。無論是作為廚師，還是開洗衣店，都不是體面的職業(yè)，也缺少穩(wěn)定的收入。

1.2.6 大腸埃希菌同源性PCR鑒定 用腸桿菌科基因間重復共有序列(ERIC)對大腸埃希菌分離株進行PCR擴增和指紋圖譜分析。上游引物序列ERIC1R:5′-ATGTAAGCTCCTGGGATTCAC-3′，下游引物序列ERIC2:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。PCR反應體系(25 μL)： 12.5 μL 2×PCR Master Mix酶，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94℃5 min；94℃ 30 s，48℃ 80 s，72℃ 2 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 毒力相關基因檢測 用PCR方法對大腸埃希菌分離株的毒力相關基因進行擴增，選擇的25種毒力相關基因：eae、F4、F5、F6、F18、F41、LT、STa、STb、EAST1、STX1、STX2和Stx2e基因，以及fimC、fyuA、hlyF、irp2、iroN、iss、iucD、lt、ompT、tsh、va和st基因[10]。

1.2.8 血清型鑒定 參考致瀉性大腸埃希菌O抗原診斷血清(63種)使用說明書的操作步驟，用玻片凝集法對ESBL表型大腸埃希菌進行O因子血清凝集試驗，同時設5 mg/mL石炭酸生理鹽水與菌液的混合液為陰性對照。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定結果

用選擇性培養(yǎng)基和大腸埃希菌特異性引物，從322份樣品中共分離到36株大腸埃希菌分離株，分離率為11.2%。ERIC-PCR指紋圖譜分析結果表明36株菌分屬于5類帶型，即5種克隆株，部分結果見圖1。

M.DNA 標準DL 2 000;1～9.三類大腸埃希菌克隆株

M.DNA Marker DL 2 000;1-9.Three classes of clones ofE.coli

圖1大腸埃希菌Eric PCR鑒定結果(部分數(shù)據(jù))

Fig.1 Identification results ofEscherichiacoli
Ericby PCR (Part data)

2.2 耐藥性分析

2.2.1 耐藥率 對大腸埃希菌分離株進行了氨基糖苷類、β-內酰胺類、磺胺類、氯霉素類、喹諾酮類和四環(huán)素類6大類共計19種抗菌藥物敏感性檢測，各類抗菌藥物的耐藥情況見表1。其中頭孢唑林、氨芐西林、哌拉西林、氨芐西林-舒巴坦和阿莫西林-克拉維酸的耐藥率相對其他較高，為36.1%(13/36)；其次是頭孢噻肟，耐藥率為33.3%(12/36)；頭孢他啶和頭孢吡肟耐藥率為27.8%(10/36)，四環(huán)素耐藥率為25%(9/36)，復方新諾明耐藥率為22.2%(8/36)；對氨曲南的耐藥率相對較低，為13.9%(5/36)；而對氯霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星相對敏感，其耐藥率均為5.6%(2/36)；對阿米卡星、亞胺培南、美羅培南和哌拉西林-他唑巴坦全部敏感。經(jīng)系統(tǒng)判定為ESBLs表型的大腸埃希菌占36.1%(13/36)。

表1 淡水魚大腸埃希菌對抗菌藥物耐藥情況

2.2.2 耐藥譜 對魚源大腸埃希菌分離株耐受的抗菌藥物種類，對應的耐藥菌株數(shù)及百分比和主要的耐藥模式進行統(tǒng)計和分析，結果見表2。有16株分離株對所有抗菌藥物全部敏感(44.4%)，1株分離株只對1種抗菌藥物耐藥(2.8%)，6株分離株同時對2種抗菌藥物耐藥(16.7%)，其余分離株對3種以上的抗菌藥物耐藥。有4株分離株對6種～7種抗菌藥物耐藥(11.1%)，有6株分離株對8種～9種抗菌藥物耐藥(16.7%)，有2株分離株對15種抗菌藥物耐藥(5.6%)。

2.3 耐藥基因檢測

表2 36株魚源大腸埃希菌的耐藥表型

2.4 菌株進化分群

36株大腸埃希菌分離株的分群結果為A群占50%(18/36)，B1群占50%(18/36)，未檢測到B2群和D群。

2.5 毒力相關基因檢測

36株大腸埃希菌分離株fimC基因陽性34株(94.4%，34/36)，ompT基因陽性11株(30.6%，11/36)，iucD基因陽性2株(5.6%，2/36)，同時檢測到fimC基因和ompT基因的11株(30.6%，11/36)，其他毒力相關基因檢測為陰性。

2.6 血清型鑒定結果

13株ESBLs表型大腸埃希菌檢測到的O抗原血清型有O164、O8、O78和O26共4種，其中O164為優(yōu)勢血清型(76.9%，10/13)，O8、O78和O26血清型各1株。

3 討論

本研究從322份淡水養(yǎng)殖魚樣品中分離獲得36株大腸埃希菌，分離率相對較低(11.2%)。其中243份健康魚中分離到12株大腸埃希菌(5.1%)，而79份病魚樣品分離獲得24株(30.4%)，病魚大腸埃希菌攜帶率顯著高于健康魚。健康魚樣本皆為10月～次年1月間收集，而病魚樣本為7月～8月間收集，這種差異與季節(jié)因素也具有相關性[11]。

整體來說，大腸埃希菌分離株對β-內酰胺類藥物耐藥率最高(36%)，而氨基糖苷類、氯霉素類和喹諾酮類藥物耐藥率較低(6%)，耐藥率顯著低于本課題組同期對長春地區(qū)豬、雞大腸埃希菌分離株的測定結果[8-9]。另外，根據(jù)Hong XJ等[12]對廣東省水庫魚的大腸埃希菌耐藥的研究結果，氨芐西林的耐藥率最高(51%)，其次是四環(huán)素(39%)、復方新諾明(42%)和環(huán)丙沙星(37%)，耐藥率均高于本研究，這可能是由于南北環(huán)境氣候差異，南方氣溫偏高易于細菌繁殖，使用抗菌藥物頻繁，導致細菌耐藥率高于北方。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，病魚攜帶的大腸埃希菌分離株耐藥更為嚴重，24株有13株為ESBLs耐藥菌，僅有4株對測試的抗菌藥物敏感，而分離自健康魚的12株大腸埃希菌對測試的抗菌藥物全部敏感。從毒力特性分析，分離株檢測到粘附毒力相關因子fimC、離子攝取相關毒力因子icuD和保護因子ompT，這幾種毒力基因常見于分離自家禽的致病性大腸埃希菌，其中O26、O78血清型分離株亦是禽源大腸埃希菌的主要血清型，提示部分大腸埃希菌分離株可能來源于養(yǎng)殖水體中污染的家禽糞便。從病魚分離獲得的13株ESBLs表型大腸埃希菌中有11株為O164血清型，該血清型常見于腸侵襲性大腸埃希菌(enteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC)，這11株菌均攜帶fimC和ompT毒力基因，其他2株ESBLs表型菌株攜帶icuD毒力基因，血清型分別為O8和O78，而健康魚分離株均未檢測到ompT和icuD毒力基因。這些ESBLs菌株的致病性及其與耐藥表型的關聯(lián)有待于進一步研究。

本研究嘗試對ESBLs分離株進行接合轉移以研究其質粒攜帶耐藥基因的水平轉移，但試驗發(fā)現(xiàn)，這些菌株本身具有較高的疊氮鈉抗性(最小抑菌濃度為640 μg/mL)，與受體菌E.coliJ53具有相同抗性水平而失去篩選標記，因而試驗未能成功，但這一失敗結果并不表明分離株不能通過質粒介導耐藥基因的水平傳播。同時提示魚源大腸埃希菌對防腐劑的耐受性值得關注。

合理使用抗菌藥物對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)細菌性疾病的控制具有較好的效果，但近些年，由于大量盲目的使用抗菌藥物，導致細菌耐藥性日益嚴重。大腸埃希菌在多種生態(tài)環(huán)境中均扮演了耐藥基因貯存庫的角色，魚類攜帶的大腸埃希菌在與其他魚源病原菌混合感染時，可介導耐藥性的傳播，擴大危害性。在水產(chǎn)養(yǎng)殖和消費過程中，也對人類的健康構成威脅，因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中應合理選擇及使用抗菌藥物，避免不規(guī)范的低劑量預防用藥。