楚秋霞，于 翔，辛?xí)粤?，施巧婷，滑留帥，王二耀，徐照學(xué)

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸研究所,河南鄭州 450002)

信陽水牛屬于我國優(yōu)良地方品種之一。主產(chǎn)于河南省信陽市，中心產(chǎn)區(qū)為信陽市的光山、羅山、固始、商城、新縣等縣區(qū)[1]。信陽水牛具有體型大、結(jié)構(gòu)勻稱、力大持久、性情溫馴、耐粗飼等特性[2]。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)機(jī)械的發(fā)展，信陽水牛逐步從單純的役用向乳用、肉用方向轉(zhuǎn)化。信陽水牛1983年被列入《河南省地方優(yōu)良畜禽品種志》，2003年被列入《中國畜禽遺傳資源名錄》。由此可見，信陽水牛有著舉足輕重的保護(hù)價(jià)值。由于成纖維細(xì)胞是一種二倍體穩(wěn)定的細(xì)胞，本研究從培養(yǎng)成纖維細(xì)胞入手，對該細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，使信陽水牛的遺傳資源在細(xì)胞水平上得以長期保存。同時，也為體細(xì)胞克隆等研究提供理想的實(shí)驗(yàn)材料[3-4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 信陽水牛耳緣組織，共采集自12頭水牛，來自信陽水牛保種場。

1.1.2 主要試劑 高糖DMEM、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶，Gibco公司產(chǎn)品；DMSO、抗菌藥物、PI染料等試劑及藥品，美國Sigma公司產(chǎn)品；支原體，南京愛必夢試劑公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和處理 選擇健康的信陽水牛，用手術(shù)刀片除凈耳毛并消毒。采樣鉗剪下耳尖組織，750 mL/L酒精中浸泡20 s，放入含有青霉素、鏈霉素的DPBS液洗3遍，4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)

1.2.2.1 原代培養(yǎng) 無菌處理組織樣品，用眼科剪剪成 1 mm3大小的組織，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，置于37.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱，4 h加入培養(yǎng)液，隔24 h換液，3 d后觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.2.2 傳代培養(yǎng) 當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞有80%～90%匯合時，進(jìn)行傳代，采用差速消化和差速貼壁法，純化成纖維細(xì)胞[5-6]。每隔2 d換液1次，記錄生長情況。

1.2.3 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇

1.2.3.1 細(xì)胞凍存 調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個/mL，加入凍存液(100 mL/L DMSO+200 mL/L FBS+700 mL/L DMEM混合液)，放入細(xì)胞冷凍程序盒過夜，第2天投入液氮罐。

1.2.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮中取出細(xì)胞凍存管，37℃水浴中快速解凍，用培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，1 000 r/min離心3 min，重懸細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿。置入37.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.4 生物學(xué)特性研究

1.2.4.1 活力檢測 細(xì)胞凍存前和復(fù)蘇后進(jìn)行活力檢測。使用便攜式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測其活力，重復(fù)3次取平均值。

1.2.4.2 生長曲線 取指數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×104個/mL，接種到24孔培養(yǎng)板中，置入37.5℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔24 h取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)取平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.4.3 染色體分析 分別取第9代及第14代的細(xì)胞進(jìn)行染色體統(tǒng)計(jì)分析。常規(guī)方法進(jìn)行染色體制片[7-8]。

1.2.5 微生物檢測

1.2.5.1 細(xì)菌、真菌檢測 所有的待檢細(xì)胞在無抗生素培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳代后進(jìn)行檢測。在顯微鏡下觀察有無活動的黑色顆粒；取培養(yǎng)過細(xì)胞的溶液接種到細(xì)菌培養(yǎng)基，37.5℃溫箱過夜培養(yǎng)，觀察是否有菌落出現(xiàn)[9-10]。

1.2.5.2 支原體檢測 加入含有5 μg/mL Hoechst33342的DMEM培養(yǎng)基，常溫放置10 min，熒光倒置鏡下觀察，判斷是否有支原體污染[11-12]。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

組織塊培養(yǎng)3 d～4 d后便可見大量上皮樣細(xì)胞與成纖維樣細(xì)胞混雜生長，形成明顯的生長圈，1周后便可鋪滿皿底。經(jīng)2次～3次傳代，獲得較純的成纖維細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后大致呈梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞核位于中央，生長時呈放射狀、漩渦狀走向。原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞見圖1和圖2。

2.2 細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后活率

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀活力測定，細(xì)胞凍存前活率平均達(dá)98.5%，復(fù)蘇后活率平均達(dá)96.1%，細(xì)胞在凍存前和復(fù)蘇后活率達(dá)95%以上。說明細(xì)胞生長狀態(tài)很好。

圖1 原代細(xì)胞(100×)

2.3 細(xì)胞生長曲線

生長曲線呈“S”型，經(jīng)歷了潛伏生長期、指數(shù)生長期及平臺期。生長曲線表明信陽水牛成纖維細(xì)胞生長具有正常的分裂增殖特性(圖3)。

2.4 染色體分析

信陽水牛第9代和第14代染色體核型見圖4和圖5。隨著代數(shù)的增加染色體數(shù)目有明顯的減少。通過流式檢測細(xì)胞倍型(圖6)，信陽水牛XY3-P9、XY10-P9及XY3-P14二倍體倍型分別為97.85%、97.94%和76.35%。顯示通過細(xì)胞染色體倍性分析發(fā)現(xiàn)，信陽水牛成纖維細(xì)胞在第9代時具有正常的二倍體，二倍體比例在90%以上；而在14代時染色體數(shù)目及二倍體所占比例出現(xiàn)明顯的變化。

圖2 傳代細(xì)胞(100×)

圖3 信陽水牛成纖維細(xì)胞生長曲線

圖4 第9代信陽水牛成纖維細(xì)胞染色體(40×)

圖5 第14代信陽水牛成纖維細(xì)胞染色體(100×)

A.XY3-F9；B.XY10-F9；C.XY3-F14

圖6信陽水牛成纖維細(xì)胞倍型分析

Fig.6 Ploidy analysis of Xinyang buffalo fibroblasts

2.5 微生物污染檢測結(jié)果

待檢細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌、真菌污染檢測，結(jié)果表明，無渾濁或其他變化，檢測結(jié)果為陰性。在相差顯微鏡下觀察，未見有病毒造成的細(xì)胞損傷現(xiàn)象。使用Hoechst 33342 熒光染料檢測第6代信陽水牛成纖維細(xì)胞有無支原體污染，結(jié)果顯示細(xì)胞表面光滑，僅細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光，細(xì)胞周圍無絲狀或顆粒狀熒光點(diǎn)，檢測支原體結(jié)果為陰性(圖7)，支原體陽性對照組見圖8。

圖7 支原體陰性(40×)

圖8 支原體陽性(100×)

3 討論

細(xì)胞原代培養(yǎng)常用有2種方法，即消化法和組織塊貼壁法培養(yǎng)。組織塊貼壁法操作簡單方便，長出的細(xì)胞整齊且對細(xì)胞損傷少，此法是建立成纖維細(xì)胞系的主要方法[13]。成纖維樣細(xì)胞是由真皮層細(xì)胞分裂增殖而來，源于中胚層。上皮樣細(xì)胞源于外胚層的細(xì)胞，所以首先生長的是上皮樣細(xì)胞。成纖維樣細(xì)胞由于母細(xì)胞數(shù)量少生長較慢。由此可見，本試驗(yàn)培養(yǎng)的信陽水牛耳組織在培養(yǎng)第3天首先出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞，隨后出現(xiàn)大量的成纖維細(xì)胞。1周后進(jìn)行傳代，對比發(fā)現(xiàn)信陽水牛比南陽牛成纖維細(xì)胞生長整齊，內(nèi)皮細(xì)胞較少。

根據(jù)消化細(xì)胞所使用消化液的情況，本試驗(yàn)采用2.5 mg/mL胰蛋白酶和0.2 mg/mL EDTA聯(lián)合消化，所得細(xì)胞的24 h 貼壁率明顯高于不添加0.2 mg/mL EDTA的消化液，并且消化細(xì)胞所需時間短。根據(jù)胰酶對細(xì)胞的消化時間和附著時間不同進(jìn)行細(xì)胞純化[14]。信陽水牛成纖維細(xì)胞在第3代時獲得較純的成纖維細(xì)胞，細(xì)胞生長狀態(tài)很好。生長曲線呈“S”型，符合細(xì)胞的正常生長規(guī)律。細(xì)胞的冷凍保存為動物資源的長期保存提供了有效的保存方法。影響細(xì)胞凍存的因素有冷凍溫度、冷凍速度、凍融速度及冷凍保護(hù)劑類型。通過對信陽水牛成纖維細(xì)胞凍存前與復(fù)蘇后的存活率測定，凍存前與復(fù)蘇后的存活率均在95%以上，復(fù)蘇后細(xì)胞生長旺盛，具有正常的細(xì)胞形態(tài)。

染色體檢查是檢測染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)有無異常的方法。在動物上主要用于檢測染色體的數(shù)目是否保持正常的數(shù)目，以及核型是否完整，判斷培養(yǎng)的細(xì)胞是否具有長期保存的價(jià)值。體外培養(yǎng)的信陽水牛成纖維細(xì)胞進(jìn)行9代及14代染色體檢測，結(jié)果顯示，信陽水牛成纖維細(xì)胞第9代染色體數(shù)目為2N=60條，與沼澤型水牛染色體數(shù)目不一致，而為黃牛的染色體數(shù)，推測所采集的信陽水?？赡芙?jīng)過長期的選育形成的雜交品種。在第14代時染色體數(shù)目為41條，染色體數(shù)目明顯的減少。通過流式細(xì)胞儀對二倍體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，信陽水牛XY3-P9、XY10-P9及XY3-P14二倍體倍型分別為97.85%、97.94%和76.35%。說明在10代之前細(xì)胞遺傳性能比較穩(wěn)定，然而隨著體外培養(yǎng)傳代代次的增加出現(xiàn)了變異。因此，在進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)時，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的情況對細(xì)胞進(jìn)行檢測。

預(yù)防細(xì)胞污染是體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本要求。細(xì)胞被細(xì)菌和病毒類污染容易發(fā)現(xiàn)，但是支原體污染卻不易發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)通過使用Hoechst 33342 熒光染料檢測信陽水牛成纖維細(xì)胞，支原體檢測結(jié)果顯示細(xì)胞表面光滑，檢測結(jié)果為陰性。在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁，易被忽視[15]。細(xì)胞被支原體污染后嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長發(fā)育，因此對細(xì)胞支原體的檢測至關(guān)重要。