陳 競，齊 強，羅永仁，張 皓，李成輝，任春宇，車 達，姜永越，于建華，金 鑫*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；2.琿春邊境經(jīng)濟合作區(qū)綜合服務(wù)站，吉林琿春 133315；3.延邊州畜牧總站，吉林延吉 133000；4.延邊州動物疫病預(yù)防控制中心，吉林延吉 133000； 5.圖們市農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)局，吉林圖們 133000)

氣腫疽(Gangraena emphysematosa)又被稱為黑腿病或鳴疽。在自然條件下，氣腫疽主要侵害牛[1]，低濕的沼澤和潮濕的山地發(fā)病率較高，故夏季高發(fā)。氣腫疽梭菌(Clostridiumchauvoei)首先由Feser(1876)和Bollinger(1875)提出，Roux在1887年順利分離出病原體。在一定條件下，氣腫疽梭菌主要通過消化道、皮膚感染，患處破潰或尸體處理方法不當(dāng)都會使病原菌從體外流出，形成的芽胞會污染土壤，在土壤中存活時間可長達3年。氣腫疽梭菌對藥物和氣候條件等刺激性因素有極強的抵抗力[2-4]。氣腫疽主要發(fā)病部位是肌肉最豐滿的地方，按壓有捻發(fā)音，患畜常伴有跛行。飲用被污染的水源和吞食飼草是導(dǎo)致牲畜感染的主要途徑，受傷的喉嚨、口腔和或者經(jīng)微創(chuàng)的胃腸道黏膜也易于導(dǎo)致氣腫疽梭菌侵入機體[5-6]?？蒲腥藛T一直認為氣腫疽梭菌不會感染人類，但新發(fā)現(xiàn)的病例動搖了這一看法，日本于2007年報道了有關(guān)人感染氣腫疽梭菌后死亡的案例，因此，該病的發(fā)生受到了其他國家的重視并且列為重要研究對象[7]。我國在新中國成立之初，該病在中原等多處地區(qū)也曾發(fā)生過大面積流行和暴發(fā)，截止到目前，我國約20多個省市和自治區(qū)出現(xiàn)過該病[8]。

隨著氣腫疽梭菌研究的不斷深入，尋找準確有效的疫苗控制氣腫疽顯得尤為重要。由于該病目前沒有非常有效的治療性藥物，因此疫苗的研發(fā)是急待解決的問題[9]?，F(xiàn)階段僅有部分滅活苗在試驗中取得良好的效應(yīng)，但應(yīng)用到實際當(dāng)中的疫苗少之又少；傳統(tǒng)的滅活苗保護性差，弱毒疫苗存在較大的安全隱患，因此核酸疫苗、蛋白質(zhì)亞單位疫苗等新型疫苗的研發(fā)和推廣具有廣闊的前景[10-11]。在氣腫疽梭菌的毒力因子中，鞭毛蛋白、唾液酸酶和細胞毒素均為較好的疫苗候選基因[12]，其中氣腫疽梭菌CctA是具有重要研究價值的候選基因，因用于研制氣腫疽疫苗的主要保護性抗原而被重視。本試驗預(yù)測和分析了延邊株氣腫疽梭菌的信息，構(gòu)建了氣腫疽梭菌pcDNA3.1-CctA質(zhì)粒并成功表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株及試劑 氣腫疽梭菌為延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室分離保存；封閉群豚鼠和Balb/c小鼠，吉林省長春億斯公司；Vero細胞，哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；pMD19-TSimpleVector，TaKaRa寶生物有限公司；鼠抗氣腫疽梭菌CctA蛋白，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室制備；辣根過氧化物酶標(biāo)記的Anti-mouseIgG，美國Sigma公司產(chǎn)品；熒光素FITC標(biāo)記的Anti-mouseIgG，北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液，北京Gibco生物公司產(chǎn)品；Opti-MEM?IReducedSerumMedium，美國Gibco公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI、KpnI，DNA連接酶T4，DNA聚合酶ExTaq，DNA Marker DL 3 000，DNA Marker DL10 000，10×ExTaqbuffer，10×loadingbuffer，6×loadingbuffer，RNase寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒，OMEGA生物公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒、抗生素Kana、Amp，Newbioindustry公司產(chǎn)品；Trans5α感受態(tài)cell，北京全式金生物公司產(chǎn)品；DAB顯色液，北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體試劑盒LipofectamineTM2000，美國Invitrogen公司產(chǎn)品；胰酶消化液、磷酸鹽緩沖液(北京索萊寶生物公司產(chǎn)品)；Tris、溴化乙錠等，北京生工產(chǎn)品；丙烯酰胺、過硫酸銨，其他試劑為國產(chǎn)級分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)在GenBank上發(fā)表的氣腫疽梭菌CctA基因(序列號：JQ692583)，應(yīng)用Primer Premier5.0軟件設(shè)計了1對引物(引物由北京新產(chǎn)業(yè)生物公司合成)，上游5′端各帶有BamHⅠ和Kozak序列，下游3′端帶有XhoⅠ和TAA終止密碼子，P1 5′-GGATCCGCCACCATGGGTGGGTATTATCAAGCTGATAT-3′；P2 5′-CTCGAGTTAAGTTCCTTTTGGTGCTGTAAGAG-3′。

1.2.2 基因擴增 提取鑒定后的氣腫疽梭菌的DNA，并用PCR方法檢測與鑒定。P1、P2，作為引物擴增CctA基因。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 45 s；48.8℃ 45 s；72℃ 1 min，共30個循環(huán)；再72℃ 10 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 氣腫疽梭菌CctA基因的克隆和鑒定 將經(jīng)PCR擴增的目的片段CctA基因，與pMD19-TSimpleVector載體混合進行連接(16℃，2 h或4℃過夜)，將連接產(chǎn)物加入到Trans5α感受態(tài)細胞中混合進行轉(zhuǎn)化，提取重組質(zhì)粒pMD19-T-CctA，以pMD19-T-CctA作為模板用上述引物進行PCR鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CctA構(gòu)建、鑒定 提取pcDNA3.1和pMD19-T-CctA，采用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，回收pcDNA3.1目的片段和氣腫疽梭菌CctA，將雙酶切后的CctA基因片段與載體pcDNA3.1片段混合(16℃，12 h)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，進行培養(yǎng)，提取pcDNA3.1-cctA重組質(zhì)粒，鑒定。

1.2.5 Vero細胞培養(yǎng) 將Vero細胞立即從液氮中取出，復(fù)蘇，培養(yǎng)，傳代。

1.2.6 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CctA表達與分析 將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CctA在長勢良好的Vero細胞中進行轉(zhuǎn)染，進行CctA基因的表達，并用SDS-PAGE電泳分析CctA基因的表達產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 CctA基因的擴增

以上述氣腫疽梭菌CctA基因作為模板，P1、P2作為引物，進行PCR擴增。得到的目的片段大小與預(yù)期CctA基因片段相同，目的基因大小為519 bp(圖1)。

M.DNA標(biāo)準DL 3 000 ；1～4.CctA基因的PCR擴增產(chǎn)物；5.陰性對照(ddH2o)

M.DNA Marker DL 3 000; 1-4.PCR products of CctA gene; 5.Negative control

圖1 CctA基因的擴增

Fig.1 Amplification of CctA gene

2.2 pMD19-T-CctA質(zhì)粒的PCR鑒定

以pMD19-T-CctA作為模板，PCR鑒定得到與預(yù)期目的片段大小相同的CctA基因片段，目的基因大小為519 bp(圖2)。

M.DNA 標(biāo)準DL 3 000 ；1～2.pMD19-T-CctA PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 3 000; 1-2.PCR products of 19-T-CctA

圖2 pMD19-T-CctA質(zhì)粒的PCR鑒定

Fig.2 PCR identification of pMD 19-T-CctA

2.3 重組質(zhì)粒pMD19-T-CctA的PCR及雙酶切鑒定

將初步鑒定的重組質(zhì)粒，以XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，PCR鑒定得到2條與預(yù)期相同的2 692 bp和519 bp目的片段，獲得了重組質(zhì)粒pMD19-T-CctA(圖3)。

2.4 pcDNA3.1-CctA重組表達質(zhì)粒PCR鑒定

以重組質(zhì)粒作為模板，P1、P2作為引物，PCR鑒定得到與預(yù)期目的片段大小相同的CctA基因片段，目的基因大小為519 bp(圖4)。

2.5 pcDNA3.1-CctA重組表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將PCR初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CctA，以BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，37℃條件下酶切2 h，分別得到5 428 bp和519 bp兩條目的片段(圖5)。

M.DNA 標(biāo)準DL 3 000 ；1～4.pMD19-T-CctA雙酶切產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 3 000; 1-4.Double enzyme digestion products of pMD 19-T-CctA plasmid

圖3 pMD19-T-CctA質(zhì)粒雙酶切鑒定

Fig.3 Double enzyme digestion of pMD19-T-CctA plasmid

M.DNA標(biāo)準DL 3 000 ；1.pcDNA3.1-CctA產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 3 000; 1.PCR products of pcDNA3.1-CctA

圖4 DNA3.1-CctA質(zhì)粒的PCR鑒定

Fig.4 PCR identification of pcDNA3.1-CctA

M.DNA標(biāo)準DL 10 000；1.pcDNA3.1-CctA質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 10 000 ; 1.Double enzyme digestion products ofpcDNA3.1-CctA plasmid

圖5 pcDNA3.1-CctA質(zhì)粒的雙酶切鑒定

Fig.5 Double enzyme digestion of pcDNA3.1-CctA plasmid

2.6 pcDNA3.1-CctA質(zhì)粒CctA基因的表達鑒定

將Vero細胞鋪板培養(yǎng)，待細胞生長狀態(tài)良好且鋪至板底約60%～80%方可轉(zhuǎn)染，分別將pcDNA3.1-CctA重組質(zhì)粒和pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Vero細胞中，進行免疫熒光檢測，顯微鏡下觀察(圖6)，pcDNA3.1-CctA組細胞可觀察到綠色熒光，pcDNA3.1空質(zhì)粒組和Vero細胞組未觀察到綠色熒光，說明重組質(zhì)粒中的CctA基因能夠成功在Vero細胞中表達。

3 討論

本試驗對延邊氣腫疽梭菌CctA基因的核苷酸序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)核苷酸序列的同源性為99.4%，氨基酸序列的同源性為98.8%，為單克隆抗體的制備及核酸疫苗的研制奠定了一定的基礎(chǔ)。真核表達載體pcDNA3.1含有CMV啟動子，并具有多克隆位點、AMP+抗性基因及BGHpolyA加尾信號和SV40早期啟動子，這樣既可保證目的基因CctA長期穩(wěn)定的表達在Vero細胞中，同時也可以提高表達概率，防止在后續(xù)轉(zhuǎn)染細胞過程中丟失質(zhì)粒[13-15]。在擴增的CctA基因特異性引物中引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，更好地連接了基因片段和表達載體。將pcDNA3.1載體引入一個內(nèi)含子，滿足了今后pcDNA3.1-CctA質(zhì)粒用來做DNA疫苗對內(nèi)含子的需求。真核細胞內(nèi)外源基因表達的過程中，本試驗以LipofectamineTM2 000為轉(zhuǎn)染試劑，通過間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-CctA質(zhì)?？稍赩ero細胞中成功表達。

A.pcDNA3.1-CctA；B.pcDNA3.1空質(zhì)粒對照；C.正常細胞對照A.Recombinant plasmid pcDNA3.1-CctA; B.Eukaryotic expression vector pcDNA3.1 control; C.Vero cell control 圖6 間接免疫熒光檢測CctA基因的表達(200×)

目前有關(guān)核酸疫苗在人類及動物產(chǎn)生預(yù)防和治療作用的研究報道及關(guān)注度不斷增加，應(yīng)用范圍也逐漸擴大。人們急迫地期望用核酸疫苗來治療諸如微生物感染性疾病、寄生蟲病等頑癥，并應(yīng)用于腫瘤、遺傳病和其他多種疾病的基因水平治療，并在多方面進行了大量的研究。非病毒微生物在感染宿主時，非病毒微生物蛋白都由微生物本身表達，而不是通過宿主細胞表達，因此核酸疫苗免疫機體后，在真核細胞內(nèi)表達的非病毒微生物蛋白有可能產(chǎn)生不同類型的非自然感染狀態(tài)下的蛋白。但是迄今為止的試驗表明，向動物體內(nèi)注射編碼非病毒微生物蛋白的核酸疫苗后，非病毒微生物蛋白可在注射部位原位表達，引發(fā)保護動物免受非病毒微生物攻擊的免疫反應(yīng)。目前，成功用于防治非病毒微生物引起的疾病主要有結(jié)核病、肺炎支原體感染、肺炎球菌感染、幽門螺旋桿菌感染、破傷風(fēng)梭菌感染、考德里立克次體感染等。從目前的試驗結(jié)果來看，核酸疫苗的預(yù)防效果也存在著種種不足，其具體的機制仍需要進一步的研究闡明。