牛 勝，李 欣，張 寧，寧官保，張 鼎，Ali Raza Jahejo,馬海利，郝衛(wèi)芳，高文偉，趙宇軍，高詩敏，李桂蘭，李建慧，閆 芳，高榮琨，畢玉海，韓凌霞，田文霞*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801；2.太原市動物疫病預防控制中心，山西太原 030024；3.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150001；4.中國科學院微生物研究所病原微生物與免疫學重點實驗室，北京 100101)

馬立克病(Marek's disease,MD)是由馬立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的雞的一種腫瘤性疾病，每年給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，多年來人們一直在致力于MD的防控工作，并獲得了一定的成效，卻并沒有解決根本問題。近年來研究表明，機體中紅細胞除了參與呼吸循環(huán)，同時還參與免疫、代謝等生理過程。目前，關于紅細胞免疫的研究主要在人紅細胞方面較多，而在有核紅細胞方面，主要是關于魚類和爬行類的紅細胞的研究，而關于雞紅細胞的研究則剛剛開始。研究表明，白色念珠菌刺激鱒魚紅細胞后，紅細胞增加了細胞因子的表達，從而增強吞噬能力[1]。除此之外，Paolucci等發(fā)現(xiàn)紅細胞中存在一些Toll樣受體(TLR)的組成性表達，并在TLR配體刺激后產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(type I interferons，IFNs)和IL-8的誘導表達[2]。前列腺素、細胞外脂肪酸結合蛋白(extracellular fatty acid-binding protein，Ex-FABP)和谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione S-transferase,GSTs)在炎癥和免疫反應過程中發(fā)揮至關重要的作用，而環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase 2,COX2)、前列腺素E2受體4(prostaglandin E2 receptor 4,PTGER4)、前列腺素還原酶-1(prostaglandin reductase 1,PTGR1)和造血前列腺素D2合成酶(hematopoietic prostaglandin D synthase,HPGDS)參與各前列腺素的表達和調控過程。本課題組前期通過轉錄組測序篩選了這6種在MDV感染后紅細胞中存在差異表達的免疫相關因子，本研究采用雙重實時熒光定量PCR檢測感染MDV后雞羽髓中的病毒載量，并通過real-time PCR技術對雞紅細胞中這6種免疫相關因子(COX2、Ex-FABP、GSTA3、PTGER4、PTGR1和HPGDS)的轉錄水平進行鑒定，以驗證紅細胞中是否存在表達，并進一步研究在感染MDV后紅細胞中這些基因的免疫應答反應，以初步探索在感染MDV后這些免疫相關因子可能的免疫作用。未來需探明這些免疫相關因子在MDV感染過程中的免疫機理，并期望運用此類免疫相關因子來參與馬立克病的防治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與毒株 馬立克病病毒超強毒株MD5、20羽1日齡MHC-B15單倍型SPF雞，由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 Trizol(AA909-1)、反轉錄試劑盒(AK3020)、熒光定量PCR試劑盒(AK6003)，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；PBS(phosphate buffered saline)，北京Solarbio科技有限公司產(chǎn)品；pMD-O 和pMD-M質粒，由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 馬立克病病毒感染試驗 1日齡B15單倍型SPF雞20羽，分為攻毒組和對照組(每組各10羽)。飼養(yǎng)至4日齡后，將攻毒組每只雞腹腔注射MD5血毒500 PFU(0.5 mL)，對照組注射相同體積的PBS緩沖液。在接毒后第4、7、9、14天分別從兩組雞中各收集4～5根羽毛，保存于液氮中。并在接毒后第14天和第22天每組隨機選取3只雞進行心臟采集抗凝血(2 mL/羽)，分離紅細胞。

1.2.2 檢測SPF雞羽髓中MDV載量 將收集的羽毛通過常規(guī)酚-氯仿法提取羽髓中DNA[3]，并測定DNA濃度及純度，稀釋至100 ng/μL，因超強毒株MD5 Ⅰ型血清具有特有基因meq，因此以此基因為檢測病毒的目的基因，以雞卵鐵轉蛋白(ovo)為內參基因，建立雙重實時熒光定量PCR方法，并以此檢測攻毒后羽髓中病毒拷貝數(shù)，其中meq基因及ovo基因的熒光素標記探針和引物序列參照文獻合成[4]，具體見表1。通過雙重實時熒光定量PCR繪制標準曲線及檢測病毒拷貝數(shù)，具體操作見參考文獻[4]。

1.2.3 紅細胞總RNA提取與反轉錄 用Trizol法提取紅細胞總RNA，對提取的RNA分別用瓊脂糖凝膠電泳和核酸測定儀進行質量和濃度檢測。根據(jù)反轉錄試劑盒操作步驟，將合格的RNA反轉錄為cDNA，用于后續(xù)的real-time PCR試驗。

1.2.4 Real-time PCR檢測各基因轉錄表達水平 根據(jù)NCBI中目的基因mRNA序列設計引物，由上海捷瑞公司合成，引物序列見表2，后通過real-time PCR技術對各基因COX2、Ex-FABP、GSTA3、PTGER4、PTGR1、HPGDS的mRNA表達水平進行檢測。18S rRNA作為內參基因，每個樣本設4個重復，反應體系及操作步驟參考文獻進行[5]。

表1 雙重實時熒光定量PCR的引物及探針信息

表2 定量PCR引物信息

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 以第14天對照組為參照，使用2-△△Ct法計算目的基因在各組中的相對表達量，并用SPSS Statistics 17.0軟件進行差異顯著性分析。顯著性用不同字母表示(a～d)。

2 結果

2.1 感染MDV后羽髓中病毒載量變化

通過雙重實時熒光定量PCR分別對感染MDV后第4、7、9和14天的羽髓中病毒載量進行檢測，結果顯示在對照組中沒有檢測到MDV拷貝；在攻毒組中第7天后檢測到MDV的拷貝，并且在第14天檢測到的MDV拷貝數(shù)顯著高于其他檢測時間(圖1)。

a表示差異顯著(P<0.05)a=significant differences (P<0.05)

2.2 感染MDV后雞紅細胞中各基因的mRNA表達變化

Real-time PCR結果顯示，MDV感染后第14天，與對照組相比，攻毒組COX2的表達顯著上調(P<0.05)，而在第22天COX2的表達整體高于第14天(P<0.05)；在第14天和第22天，PTGER4、HPGDS和GSTA3在攻毒組中的表達量顯著低于對照組(P<0.05)；與之相反，在第14天和第22天，PTGR1在攻毒組中的表達量顯著高于對照組(P<0.05)；第14天攻毒組的Ex-FABP表達水平顯著低于對照組，而在第22天攻毒組表達量顯著高于對照組(P<0.05)(圖2)。

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)，紅細胞除了作為運輸氧氣和二氧化碳的主要載體，還具有識別、粘附、殺傷抗原和清除免疫復合物等免疫調控功能。Morera[6]對虹鱒魚和雞的轉錄組進行了分析，提示紅細胞在免疫應答方面發(fā)揮一定作用。本研究結果顯示，雞紅細胞中存在六種免疫相關基因COX2、Ex-FABP、GSTA3、PTGER4、PTGR1和HPGDS的轉錄表達，這表明這些基因的表達可能參與紅細胞的免疫調節(jié)作用。

a～d表示差異性(P<0.05)

Lowercase letters (a-d) indicate statistically significant differences (P<0.05)

圖2 COX2、PTGER4、PTGR1、HPGDS、GSTA3和
Ex-FABP的mRNA表達變化

Fig.2 Expression changes of COX2,Ex-FABP,GSTA3,PTGER4,
PTGR1 and HPGDS in erythrocyte of MD5

本試驗結果顯示，感染MDV后雞羽髓中病毒拷貝數(shù)在第14天顯著升高，這表明在第14天病毒在體內大量增殖，可能從此階段開始造成對機體嚴重的損傷和感染。近年來研究顯示，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的合成異常與多種疾病密切相關，特別是促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。COX是前列腺素合成過程中的關鍵酶。COX分為兩種COX1和COX2，COX1主要調節(jié)正常的生理過程，而COX2被認為廣泛地參與炎癥反應[9]。有研究表明，COX2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，具有促血管生成，促進腫瘤細胞增殖與轉移的作用，并與腫瘤細胞的凋亡抵抗等密切相關[10-11]。COX2藥理性或遺傳性的失活會抑制腫瘤細胞的生長和存活，同時抑制腫瘤的生長、侵襲和轉移[12]。有試驗發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中都檢測到了COX2和PGE2的高表達，這種高表達與腫瘤的發(fā)展密切相關[13]。從本試驗結果可以發(fā)現(xiàn)，與第14天對照組相比，紅細胞中COX2的mRNA水平在第14天攻毒組中顯著上調，而在第22天對照組與攻毒組表達水平整體顯著上調，這表明在此階段，隨著病毒在體內大量增殖與感染，紅細胞也通過COX2基因上調表達引起PGE2的合成增加，從而參與機體的免疫調節(jié)作用，這一結果可能與淋巴瘤細胞增殖有關。

HPGDS是催化PGD2生成的一類關鍵酶，也是Σ類谷胱甘肽S-轉移酶家族之一[14-15]。 GSTs是一類具有多種生物功能的酶[16]，GSTs酶活性的改變可引起正常細胞代謝的改變，使得機體正常細胞對毒害物質的清除能力下降[17]，抗氧化機能減弱甚至喪失，對疾病尤其是腫瘤的易感性增強[18]。real-time PCR結果顯示，分別在第14天和第22天，攻毒組HPGDS和GSTA3的mRNA表達量持續(xù)下調，這表明機體在感染病毒后，HPGDS在感染MDV之后表達受到抑制，從而抑制PED2的表達。隨著免疫抑制及紅細胞中GSTA3的表達降低，導致機體抗氧化能力減弱，利于腫瘤細胞的活化、增殖及轉移。

Ex-FABP參與炎癥性疾病，能夠隨著炎性因子增加而表達量上升[19]，在雞胚肝臟受到炎性因子脂多糖刺激后，Ex-FABP表達量增強[20]。Ex-FABP是一種急性期蛋白，在病理性的應激條件(如退化性疾病、腫瘤等)下能激活該蛋白的表達[21]。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，攻毒組紅細胞中Ex-FABP的mRNA水平在第14天表達量下調，而在第22天表達量上調極顯著，這表明在MDV大量增殖初期Ex-FABP的表達受到明顯抑制，而隨著進一步感染加劇，Ex-FABP表達急劇升高以作為抵抗腫瘤惡化的一類效應分子。

PGE2的受體分為4種亞型，分別為PTGER1、PTGER2、PTGER3、PTGER4。近年來有研究顯示，在腫瘤細胞侵襲過程中，PTGER4參與了其遷移過程[22]，已有證據(jù)表明COX-PGES-PGE2-PTGER信號傳導通路與多種腫瘤的發(fā)生相關[23-24]，Brouxhon等人發(fā)現(xiàn)在紫外線誘導發(fā)生的皮膚腫瘤中，敲除PTGER4基因可增強了腫瘤的轉移[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在雞感染MDV后第14天和22天，紅細胞中PTGER4的mRNA表達量顯著下調，這說明機體紅細胞在病毒大量增殖初期做出了一定的調控以減少PTGER4的表達，并抑制COX-PGES-PGE2-PTGER信號通路，從而抑制淋巴腫瘤轉移及惡化。隨著疾病的發(fā)展，PTGER4的表達量逐漸上升，機體抑制淋巴腫瘤轉移的能力逐漸降低。

PTGR1參與炎癥和抗氧化反應，能夠參與類花生酸代謝，如PGE2、15-脫氫-△-12,14-前列腺素J2和前列腺素A4[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，在體外的肝癌細胞樣品中，整個腫瘤細胞發(fā)展階段，PTGR1基因一直處于過表達的狀態(tài)，這種高表達，有助于癌細胞的增殖及提高腫瘤細胞的轉移功能[27]。本試驗中，在第14天及22天的攻毒組紅細胞中PTGR1的mRNA水平顯著上調，這說明感染后紅細胞中PTGR1的上調表達可能是淋巴腫瘤的發(fā)生引起的，這與之前的腫瘤相關研究結果相一致。

綜上所述，雞紅細胞中存在COX2、Ex-FABP、GSTA3、PTGER4、PTGR1和HPGDS共6種免疫相關基因的轉錄表達。在感染MDV后第14天羽髓中病毒增殖顯著升高，同時證明紅細胞中這6種基因在MDV感染后都有顯著的免疫應答，并且紅細胞可通過調控前列腺素代謝對MDV感染過程發(fā)揮了一定的免疫調控作用。