唐海波，彭可可，陳鳳蓮，白安斌，劉金鳳，吳健敏*

(1．廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；2.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧 530001；3．廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530001；4.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004)

阿卡斑病(Akabane disease)又名赤羽病，是由阿卡斑病毒 (Akabane virus,AKAV) 引起的，以昆蟲為傳播媒介的一種牛、羊重要病毒性傳染病，可引起牛、綿羊和山羊流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、木乃伊胎及新生兒關(guān)節(jié)彎曲和積水性無腦癥及腦炎等。該病于20世紀30年代在澳大利亞的牛、羊群中流行，隨后日本亦有報道。1972年-1973年，在日本關(guān)東以西的牛群中暴發(fā)，損失犢牛5萬頭以上[1-2]。除日本、澳大利亞以外，以色列、沙特阿拉伯、科威特、也門、巴林、土耳其、印度尼西亞、韓國和阿拉伯聯(lián)合酋長國等國或地區(qū)相繼報道本病[3-8]。阿卡斑病給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，對養(yǎng)牛、養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展構(gòu)成巨大威脅，已引起普遍重視，是國際動物貿(mào)易重點檢疫對象。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，我國《進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》將其列為二類動物疫病，是我國從國外進口牛、羊必檢的疫病之一。

新型竹鼠源阿卡斑病是國內(nèi)外首次報道的在自然環(huán)境下引起大規(guī)模的成年竹鼠死亡的病例。迄今，國內(nèi)外沒有任何關(guān)于該病毒的基因參考序列。2013年11月～12月廣西柳州三江、2014年4月～5月廣西桂林及2016年6月～8月廣西柳城3個不同地區(qū)縣市先后分別在人工養(yǎng)殖的竹鼠群中暴發(fā)一種怪病。據(jù)不完全統(tǒng)計，有11個竹鼠養(yǎng)殖場(三江3個場，桂林5個場，柳城3個場)共計3萬多只竹鼠受影響。該病臨床特征是在單側(cè)或雙側(cè)后腿麻痹、拖行，顫抖、轉(zhuǎn)圈、幼年竹鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，抽搐、四肢僵直，口鼻、耳朵、眼眶、前后肢等少毛或無毛的部位皮膚出現(xiàn)紅疹，部分足掌龜裂。發(fā)病竹鼠，食欲下降或不食，出現(xiàn)癥狀后1 d～3 d內(nèi)發(fā)生死亡。因其都表現(xiàn)出后腿拖行現(xiàn)象，且為烈性發(fā)病，在廣西俗稱為 “拖垃圾病”。剖檢可見大腦充血、出血，肺有出血點、出血斑，肝質(zhì)脆、色淺，脾腫大、部分梗死，腎有出血點。幼年和成年竹鼠均發(fā)病，發(fā)病率20%～30%，但死亡率幾乎100%[9]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，竹鼠養(yǎng)殖場之間存在相互引種外，大多數(shù)發(fā)病場之間無明顯其他聯(lián)系。細菌分離結(jié)果顯示除大腸埃希菌外，未見其他有意義的致病菌。RT-PCR或PCR 檢測痘病毒、皰疹病毒、腺病毒、淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、狂犬病病毒、仙臺病毒常見大鼠病毒均為陰性。經(jīng)本課題組診斷排除了其他細菌和病毒病，通過病毒宏基因組學(xué)、RT-PCR 擴增和細胞分離培養(yǎng)證實該病為AKAV感染。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株對竹鼠屬于強毒力。

隨著我國特種動物養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，竹鼠養(yǎng)殖業(yè)得以不斷壯大，而目前國內(nèi)外在新型竹鼠源阿卡斑病毒性疾病領(lǐng)域的研究和報道還處于空白狀態(tài)，沒有任何參考文獻和序列報道，臨床上針對新型竹鼠源AKAV病的防治處于空白狀態(tài)。因此，急需一種快速檢測新型竹鼠源AKAV病的方法，來對發(fā)病竹鼠進行及時診治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與陽性病料組織 新型竹鼠源AKAV Vero細胞培養(yǎng)液由本實驗室分離并保存，用于提取RNA的新型竹鼠源AKAV滴度為106.33TCID50/0.1 mL。竹鼠細小病毒由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所分離并保存、竹鼠內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒、竹鼠圓環(huán)病毒及竹鼠乳酸脫氫酶增高病毒陽性竹鼠組織樣品由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 AXYGEN體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；2×EsTaqMasterMix 購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker DL 2 000、pMD-18T 購自TaKaRa公司。

1.1.3 實驗動物 12 只70日齡的健康銀星竹鼠購自南寧市金誠雙豐農(nóng)牧科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AKAV竹鼠顱內(nèi)接種致病試驗及組織樣品收集 將12只70日齡的健康銀星竹鼠隨機分成2組，每組6只，第1組每只通過顱內(nèi)注射0.05 mL，病毒滴度為106.33TCID50/0.1 mL的Vero細胞培養(yǎng)液；第2組每只顱內(nèi)注射等量DMEM。注射后連續(xù)觀察記錄竹鼠發(fā)病死亡情況，并及時收集瀕死竹鼠無菌剖解，肉眼觀察大體病理損傷，取腦、心、肝、脾、肺、腎，進行發(fā)病竹鼠不同組織器官病毒核酸豐度測定。

1.2.2 引物的設(shè)計與合成 分別擴增2013年三江分離的1株竹鼠源AKAV的S基因和2016年柳城分離的5株病毒的全基因序列。測序結(jié)果已上傳GenBank，獲得登錄號分別為KY385908和KY381272-KY381286。根據(jù)測序結(jié)果得到的新型AKAV糖蛋白M基因序列的保守區(qū)域，用DNAstar、oligo6.0、 NCBI-blast等生物學(xué)軟件的綜合分析設(shè)計引物，包括一對位于核蛋白S基因的引物AKVS1和AKVS2，一對位于糖蛋白M基因的引物AKVM1和AKVM2(表1)，引物由深圳華大基因科技有限公司合成，用DEPC 處理水溶解，置-20℃保存。

表1 RT-PCR引物信息

1.2.3 竹鼠組織樣品處理及RNA模板的制備 均勻剪取性竹鼠病料組織的腦、心、肝、脾、肺、腎等組織與抽濾除菌DMEM按體積比1∶5的比例研磨制成病料懸液，分裝到1.5 mL EP管內(nèi)，經(jīng)3次凍融后，將病料懸液8 000 r/min 4℃離心5 min，取上清200 μL，同時等量吸取陽性病毒液與陰性對照。按照AXYGEN體液病毒DNA/RNA小量試劑盒操作說明提取模板RNA，產(chǎn)物直接用于RT-PCR反應(yīng)或置于-80℃保存。

1.2.4 RT-PCR 引物及引物濃度初步篩選 按1.2.3方法抽提得到的AKAV陽性樣品總RNA，用Oligo(dT)18作為下游引物進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板,使用2×EsTaqMaster Mix進行PCR 擴增。在反應(yīng)體系設(shè)為25 μL，引物濃度為20 μmol/L，PCR反應(yīng)程序：94℃ 4 min，94℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 1 min，共進行35個循環(huán)；72℃ 5 min。首先對設(shè)計的兩對引物進行初步篩選。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定以確定引物是否可以進一步優(yōu)化。進一步在引物濃度為20 μmol/L的情況下，設(shè)置10 μL～50 μL反應(yīng)體系進行PCR以確定最佳反應(yīng)體系。最后在反應(yīng)體系不變的情況，設(shè)置不同的引物濃度進行PCR，篩選最合適的引物濃度。

1.2.5 RT-PCR 退火溫度的確定 在其他反應(yīng)成分和反應(yīng)條件不變的情況下對退火溫度進行優(yōu)化，PCR反應(yīng)程序：94℃ 4 min，94℃ 30 s，53℃、57℃、60℃ 45 s，72℃ 1 min，共進行35個循環(huán)；72℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定以確定最佳退火溫度。

1.2.6 RT-PCR方法特異性與敏感性分析 分別提取新型竹鼠源AKAV、竹鼠圓環(huán)病毒、竹鼠細小病毒、竹鼠內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒、竹鼠乳酸脫氫酶增高病毒核酸。按1.2.5確定的反應(yīng)液體系及退火溫度，對本RT-PCR 方法進行特異性試驗。用蛋白質(zhì)核酸測定儀測定模板cDNA初始濃度為23 ng/μL，然后對模板cDNA進行10倍倍比稀釋后進行PCR，35個PCR循環(huán)后，檢測該方法的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 引物初步篩選與退火溫度確定

分別用引物AKVS1 和AKVS2及AKVM1和AKVM2擴增新型竹鼠源AKAV陽性樣品，初步篩選引物的特異性及穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在60℃的退火溫度下，引物AKVS1和AKVS2也能擴增出非特異目的條帶，且非特異條帶非常明顯，已影響結(jié)果判定，故被淘汰。經(jīng)過一系列優(yōu)化，確定了RT-PCR方法的反應(yīng)體系(25 μL)為：AKVM1和AKVM2濃度為20 μmol/L各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL,2×EsTaqMaster Mix 12.5 μL。

用反轉(zhuǎn)錄好的樣品cDNA作為模板，設(shè)置不同的退火溫度，其他條件均設(shè)置成相同的情況下進行PCR，結(jié)果顯示，退火溫度從53℃～60℃，目的基因片段都能獲得較高的擴增的產(chǎn)量，目的片段大小為816 bp，其中以53 ℃退火時，產(chǎn)量最高，隨著退火溫度的升高，PCR擴增目的基因片段產(chǎn)量稍有降低(圖1)，但都能明顯滿足普通PCR檢測方法的觀察判斷要求。最終確定本檢測方法的退火溫度設(shè)為57℃。

M.DNA 標準DL 2 000; 1.53℃; 2.57℃; 3.60℃; 4.ddH2O

M.DNA Marker DL 2 000; 1.53℃; 2.57℃; 3.60℃; 4.ddH2O

圖1 RT-PCR檢測方法退火溫度優(yōu)化結(jié)果

Fig.1 Optimization of annealing temperature of the RT-PCR

2.2 RT-PCR 方法的特異性

RT-PCR特異性擴增結(jié)果顯示，僅竹鼠源AKAV能擴增出特異性目的條帶，其他病毒不能擴增出目的條帶(圖2)。表明本檢測方法具有很高的特異性。

2.3 RT-PCR 方法的敏感性

結(jié)果見圖3，最終測定該方法的最低檢測量為23 pg，說明本研究建立的RT-PCR方法具有良好的敏感性。

M.DNA標準DL 2 000; 1.新型竹鼠源阿卡斑病毒; 2.ddH2O; 3.竹鼠內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒; 4.竹鼠圓環(huán)病毒; 5.竹鼠細小病毒; 6.竹鼠乳酸脫氫酶增高病毒

M.DNA Marker DL 2 000; 1.The novel AKAV isolated from bamboo rat; 2.ddH2O; 3.Bamboo rat endogenous retrovirus; 4.Bamboo rat circovirus; 5.Bamboo rat parvovirus; 6.Bamboo rat lactate dehydrogenase-elevating virus

圖2 RT-PCR檢測方法特異性試驗

Fig.2 Specificity test of the RT-PCR

M.DNA 標準DL 2 000; 1～5.cDNA濃度分別為23 ng/μL，2.3 ng/μL，230 pg/μL，23 pg/μL，2.3 pg/μL

M.DNA Marker DL 2 000; 1-5.The concentrations of cDNA 23 ng/μL，2.3 ng/μL，230 pg/μL，23 pg/μL，2.3 pg/μL,respectively

圖3 RT-PCR檢測方法敏感性試驗

Fig.3 Sensitivity test of the RT-PCR

2.4 RT-PCR方法檢測AKAV感染發(fā)病竹鼠樣品

用Vero細胞分離培養(yǎng)的新型竹鼠源AKAV顱內(nèi)接種感染6只70日齡的竹鼠，待感染組開始發(fā)病時，進行解剖并采集樣品用優(yōu)化過的RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，攻毒后發(fā)病的竹鼠腦、心、肝、脾、肺、腎組織樣品均能擴增出816 bp的特異性目的條帶，并對目的條帶進行了克隆測序，對比發(fā)現(xiàn)目的條帶為竹鼠源AKAV M基因，且與原病毒有100%的同源性(圖4)。

3 討論

我國從20世紀90 年代初發(fā)現(xiàn)本病流行，李其平等研究發(fā)現(xiàn)我國上海、廣州、福建等地各牛場常發(fā)現(xiàn)有不明原因的流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、新生胎兒關(guān)節(jié)彎曲及積水性無腦癥等。1997年上海地區(qū)部分奶牛場再次暴發(fā)了以妊娠母牛異常流產(chǎn)為典型特征的一種傳染病,異常流產(chǎn)率在10%～15%,流產(chǎn)胎兒以死胎、畸形胎居多,關(guān)節(jié)彎曲，并首次從上海采集的蚊和庫蠓中分離到AKAV[10]。近年來，云南從蚊蟲中分離到2株AKAV[11-12]。本課題組前期對采集自廣西11個市的牛羊血清進行AKAV抗體檢測，共檢測血清706份，檢測結(jié)果顯示廣西牛、羊畜群AKAV的總感染率為54.11%[13]。2016年本課題組首次從廣西柳城、三江等地大量發(fā)病死亡的竹鼠腦組織中分離到5株AKAV，確認了我國家畜中有本病流行。

M.DNA標準DL 2 000; 1.兩只感染發(fā)病竹鼠的腎; 2.肺; 3.脾; 4.肝; 5.心; 6.腦; C1.正常竹鼠腦組織對照；C2.ddH2O

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Kidney; 2.Lung; 3.Spleen; 4.Liver; 5.Heart; 6.Brain; C1:The uninfected control bamboo rat′s brain; C2:ddH2O

圖4 RT-PCR檢測方法的臨床檢測

Fig.4 Test of bamboo rat samples with the RT-PCR

迄今，竹鼠源AKAV是目前第一次報道的在自然環(huán)境下引起大規(guī)模的成年竹鼠死亡的病例。全基因測序發(fā)現(xiàn)，竹鼠源阿卡斑病毒是一種新型AKAV。基于S基因遺傳進化樹顯示，竹鼠源AKAV與中國境內(nèi)牛源AKAV親緣關(guān)系最近，同源性為99.2%。然而,基于M基因遺傳進化樹顯示，竹鼠源AKAV卻與中國境內(nèi)牛源AKAV處于不同的進化分支上，且同源性僅為91.8%。相比之下，竹鼠源AKAV M基因與來自韓國、日本的強毒株同源性高達97.7%。遺傳進化樹也處于相同的分支。換句話說，竹鼠源AKAV S基因具有中國牛源AKAV的遺傳特征，但是M、L基因卻有著韓國、日本牛源強致病性毒株的遺傳特征[9]。該病毒對成年小鼠及竹鼠具有強致病性，對牛羊是否具有強致病性目前還未知，同時該病在我國的流行狀況仍不甚明朗，今后仍需廣泛開展畜間疫情監(jiān)測尤其是病原學(xué)，包括不同家畜樣本的病毒分離和序列測定分析，同時開展蚊蟲媒介及其攜帶病毒調(diào)查，以掌握本病在我國的分布狀況、主要流行毒株和臨床特點，為防控工作提供科學(xué)依據(jù)。

本研究建立了一種快速檢測新型竹鼠源AKAV的RT-PCR方法，可在3 h內(nèi)完成擴增。同時，本方法具有較高的敏感性，可達23 pg。而特異性試驗顯示，本研究建立的RT-PCR方法具有很高的特異性?；谥袷笤碅KAV是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，目前國際上還沒有關(guān)于竹鼠源AKAV的報道。本方法的建立將填補相關(guān)技術(shù)上的空白，適用于田間、養(yǎng)殖場及口岸等大量樣品的初檢。為AKAV的防控提供技術(shù)儲備。對攻毒發(fā)病的竹鼠，采集其腦及內(nèi)臟組織器官樣品，統(tǒng)一處理后進行RT-PCR檢測?？膳卸òl(fā)病竹鼠不同組織病毒核酸豐度，其中以腦組織的含量最高，肝臟的病毒含量最低(圖4)，RT-PCR產(chǎn)物測序分析也顯示，其序列與攻毒新型竹鼠源AKAV 100%同源。總之，本研究建立的檢測方法準確可靠，解決了臨床檢測需求，為制定AKAV防控對策提供技術(shù)支撐和科學(xué)依據(jù)，對保障我區(qū)乃至全國牛、羊及竹鼠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有十分重要的意義。