丁尊俄，趙雙成，張雙翔，周碧君*，肖煥星，歐偉業(yè)，王開功，秦文學(xué)，劉 昱，胡興義，張 海，李如舉，陳 勇

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究室,貴州貴陽 550025；3.上海海利生物技術(shù)股份有限公司，上海 201403；4.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550001；5.貴州瑞特新科農(nóng)牧科技有限公司，貴州貴陽550001；6.貴州省凱里市宏大牧業(yè)發(fā)展有限公司，貴州凱里 556000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的以懷孕母豬繁殖障礙以及各年齡段豬呼吸道疾病為主要特征的一種傳染病[1-2]。因其病毒高度的變異，常有新毒株出現(xiàn)[3-4]，是PRRS免疫防控失敗的重要制約因素之一。據(jù)大量文獻顯示，我國約90%的豬場仍持續(xù)存在PRRSV，并且部分豬場中還同時存在高致病性毒株、經(jīng)典毒株等多種流行毒株[5,10]。PRRSV感染豬易導(dǎo)致免疫抑制和受環(huán)境影響，還常與其他病原，如與豬瘟病毒、副豬嗜血桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2型等混合感染或多重感染。

疫苗免疫是目前防控該病的首選手段，由于我國商品化的PRRSV疫苗類型多樣，免疫效果參差不齊，普遍存在免疫保護空白期及交叉保護率低等缺點[6]。在實際生產(chǎn)中，選擇適合豬群的PRRSV疫苗、合理的免疫程序及免疫后對豬只抗體水平的監(jiān)測成為亟待解決的問題。免疫效果評估是有效防控PRRS的重要環(huán)節(jié)，選擇合適的檢測方法尤為重要。ELISA方法具有操作簡單、快速高效、適合大規(guī)模檢測等優(yōu)點，其中比較認可的主要是針對病毒N蛋白的ELISA試劑盒(N-ELISA)和針對病毒GP和M蛋白的ELISA試劑盒(G-ELISA)[7]。本研究于規(guī)模化豬場選取具有PRRSV雙陰性仔豬，按照不同免疫程序，不同疫苗類型及組合對其進行免疫接種，采用上述兩種ELISA試劑盒檢測PRRSV特異性抗體，以期客觀評價疫苗聯(lián)用的臨床免疫效果，為養(yǎng)豬生產(chǎn)實際中有效防控PRRS提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用豬 12 d～14 d未免疫的哺乳仔豬40頭，其品種為“杜+長+大”三元雜交豬，均由貴州省凱里市宏大牧業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司提供，該豬場為農(nóng)業(yè)部認定的生豬標(biāo)準(zhǔn)化示范場，有很好的飼養(yǎng)管理及生物安全防范措施。上述仔豬及其母豬經(jīng)ELISA和實時熒光定量RT-PCR(RT-qPCR)檢測PRRSV均為陰性，同時檢測豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)和豬偽狂犬病病毒(PRV)均為陰性。

1.1.2 疫苗及主要試劑 PRRSV弱毒疫苗(CH-1R株)，10頭份/瓶；PRRSV滅活疫苗(NVDC-JXA1株)，100 mL/瓶，均由上海海利生物技術(shù)股份有限公司提供。PRRSV通用型熒光RT-PCR檢測試劑盒為北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PRRSV ELISA抗體檢測試劑盒(由N蛋白包被)為IDEXX公司產(chǎn)品；PRRSV ELISA 抗體檢測試劑盒(由GP和M蛋白包被)為LSI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗豬分組及疫苗免疫 將試驗仔豬隨機分成4組，每組10頭，于免疫前(記為0 d)， 免疫接種后7、14、21、28、35、42、49、56、63 d前腔靜脈采血約5 mL，分離血清置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，試驗豬免疫程序見表1。

表1 試驗豬免疫程序表

1.2.2 檢測方法 分別用N-ELISA和G-ELISA試劑盒檢測，具體操作過程參照各試劑盒說明書進行。 N-ELISA抗體水平用S/P值表示，S/P=(樣品OD650值-陰性對照OD650平均值)/(陽性對照OD650平均值-陰性對照OD650平均值)；G-ELISA抗體免疫水平用IRPC值表示，IRPC=[(樣品OD450-陰性對照平均值OD450)/(陽性對照平均值OD450-陰性對照平均值OD450)]×100。判定標(biāo)準(zhǔn)：PRRSV S/P值≥0.40即為抗體陽性，IRPC值>20.0即為抗體陽性。

1.2.3 統(tǒng)計分析 檢測數(shù)據(jù)用Excel 2013和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計及處理。

2 結(jié)果

2.1 仔豬免疫后PRRSV N-ELISA抗體水平檢測結(jié)果

對仔豬免疫接種后，采用PRRSV N-ELISA試劑盒檢測不同時間內(nèi)的抗體變化情況。各試驗組血清PRRSV抗體水平檢測結(jié)果見圖1、圖2。由圖1可知，在仔豬首免后21 d時，A、B、C、D 4個組陽性率分別為70%、70%、80%、0；仔豬二次免疫后28 d、56 d，A、B、C、D 4個組陽性率分別為100%、100%、90%、0；35 d、42 d、49 d、63 d，A、B、C、D 4個組陽性率分別為100%、100%、80%、0；由圖2各試驗組抗體平均水平分析可知，A、B兩組在首免后35 d抗體S/P平均值最大，分為2.311和2.466 ，C組在首免后28 d抗體S/P平均值最大，為2.147 ；在首免后35 d、42 d、49 d、56 d、63 d A、B兩組與C、D兩組抗體S/P平均值差異極顯著(P<0.01)且C、D兩組差異極顯著(P<0.01)，但A、B兩組差異不顯著(P>0.05)。說明接種兩次經(jīng)典弱毒疫苗或首免經(jīng)典弱毒疫苗二免高致病性滅活疫苗聯(lián)合使用的效果優(yōu)于只免疫接種一次的效果。

圖1 仔豬免疫后血清PRRSV N-ELISA抗體陽性率

2.2 仔豬免疫后PRRSV G-ELISA抗體水平檢測結(jié)果

對仔豬免疫接種后，采用PRRSV G-ELISA試劑盒檢測不同時間內(nèi)的抗體變化情況。各試驗組血清PRRSV抗體水平檢測結(jié)果見圖3和圖4。由圖3可知，仔豬免疫接種后21 d時，A、B、C、D 4個組陽性率分別為10%、0、10%、0；28 d時，A、B、C、D 4個組陽性率分別為20%、30%、20%、0；35 d時，A、B、C、D 4個組陽性率分別為80%、50%、70%、0；42 d、49 d，A、B、C、D 4個組陽性率分別為100%、90%、100%、0；56 d、63 d，A、B、C、D 4個組陽性率分別為100%、100%、100%、0；由圖4各試驗組抗體平均水平分析可知，在首免后21 d A、B、C 3個組在疫苗免疫后抗體IRPC平均值均呈現(xiàn)上升趨勢，在28 d～63 d，A、B、C 3個組與D組抗體IRPC平均值差異極顯著(P<0.01)，35 d A、C兩組與B組抗體IRPC平均值差異顯著(P<0.05)，56 d A、B兩組與C組差異極顯著(P<0.01)且A、B兩組差異顯著(P<0.05)，63 d A、B兩組IRPC平均值差異顯著(P<0.05)。

圖2 仔豬免疫后血清PRRSV N-ELISA抗體檢測結(jié)果

圖3 仔豬免疫后血清PRRSV G-ELISA抗體陽性率

圖4 仔豬免疫后血清PRRSV G-ELISA抗體檢測結(jié)果

3 討論

PRRSV主要引起種豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病，臨床上表現(xiàn)復(fù)雜多樣，母豬主要是發(fā)情不典型、受孕率低下、流產(chǎn)、木乃伊胎，弱仔、死胎等癥狀。仔豬主要是咳嗽、喘氣、生長緩慢、死亡率增加等癥狀。2006年，我國豬群中暴發(fā)了以豬的體溫升高、呼吸障礙、高發(fā)病率和死亡率為特征的HP-PRRS，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了災(zāi)難性損失[8-9]。近幾年來該病主要呈地方性流行，由于PRRSV感染可以引起免疫抑制和持續(xù)性感染，給PRRS的防控帶來極大困難，因此，制定科學(xué)的免疫計劃是有效防控PRRS的重要措施。目前商品化的PRRS疫苗主要有7個毒株的弱毒疫苗和3個毒株的滅活疫苗[10]，但大多數(shù)養(yǎng)殖場只單一使用其中一種疫苗來預(yù)防本病的發(fā)生。據(jù)文獻報道，弱毒疫苗與滅活疫苗聯(lián)合使用效果更佳[11-12]。本研究正是基于此，以期找到能更好預(yù)防豬場PRRS的方法。

在豬群感染PRRSV野毒或接種疫苗后，會產(chǎn)生一系列針對不同蛋白的抗體。N蛋白作為PRRSV的核蛋白，免疫原性強，感染豬主要產(chǎn)生的是針對N蛋白的抗體[13]。而N蛋白在病毒結(jié)構(gòu)內(nèi)部其產(chǎn)生的抗體不具有中和活性，檢測N蛋白抗體可以作為PRRSV感染的診斷，但不適合對疫苗免疫效果的檢測[14]。有研究表明，具有中和活性的抗體主要是針對GP5和GP2、GP3、M等結(jié)構(gòu)蛋白[15-16]。GP和M蛋白與中和抗體具有高度相關(guān)性，監(jiān)測GP和M蛋白抗體可反映保護性抗體水平[17]。本試驗結(jié)果顯示，PRRSV雙陰性仔豬首次免疫經(jīng)典弱毒疫苗后，N-ELISA抗體在14 d可以檢測到陽性，而G-ELISA抗體在21 d才檢測到抗體陽性，可能與N蛋白誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的時間比GP蛋白早有關(guān)，這與Plagemann等人的研究結(jié)果基本一致[17]，因此N-ELISA抗體的檢測可以作為PRRSV早期感染的診斷，G-ELISA抗體的檢測可以間接反映疫苗的免疫保護效果。另外，N-ELISA抗體S/P值表明，免疫接種兩次經(jīng)典弱毒疫苗組或首次免疫經(jīng)典弱毒疫苗和二次免疫高致病性滅活苗組的抗體水平差異不顯著(P>0.05)；G-ELISA抗體IRPC值表明，在免疫接種后35 d、56 d、63 d首次免疫經(jīng)典弱毒疫苗和二次免疫接種高致病性滅活苗組與免疫接種兩次經(jīng)典弱毒疫苗組差異顯著(P<0.05)；且兩種ELISA檢測結(jié)果均表明，免疫接種兩次經(jīng)典弱毒疫苗組或首次免疫接種經(jīng)典弱毒疫苗和二次免疫接種高致病性滅活苗組的抗體水平均顯著優(yōu)于只單獨免疫接種一次經(jīng)典弱毒組。

目前豬場PRRSV感染較為復(fù)雜，控制難度大，影響我國養(yǎng)豬生產(chǎn)的主要是基因2型豬繁殖與呼吸綜合征病毒，主要包括高致病性野毒株、經(jīng)典毒株、疫苗毒株、類NADC30毒株等，HP-PRRSV毒株仍是我國豬群中的優(yōu)勢流行毒株[18-19]。從理論上講，對于高致病性野毒感染豬場采用同源性高的HP-PRRS變異毒株弱毒疫苗免疫效果最好，但高致病性PRRS弱毒疫苗本身存在散毒危險和潛在的毒力返強可能性更大[20]。筆者從安全的角度考慮，采用了毒性較低的經(jīng)典毒株弱毒疫苗結(jié)合高致病性變異毒株滅活疫苗組合進行免疫，這樣不僅體現(xiàn)抗毒范圍廣，而且抗體維持時間長，對中大豬保護效果更好。試驗結(jié)果也得出了首次免疫接種經(jīng)典弱毒疫苗和二次免疫接種高致病性滅活疫苗能夠起很好的保護作用，此結(jié)果對于已感染PRRSV的豬場或受PRRSV威脅區(qū)的豬場具有重要的參考價值。