成 璐，張冬星，吳 娟，李 影

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118)

布魯菌屬是一組微小的球桿狀革蘭陰性菌，寬0.3 μm～0.6 μm，長(zhǎng)0.6 μm～1.5 μm，為無(wú)芽胞、無(wú)鞭毛、不形成莢膜的兼性胞內(nèi)病原菌，主要感染牛、羊、豬、鹿等哺乳類動(dòng)物及人[1]。根據(jù)宿主易感性不同，有6個(gè)經(jīng)典的種，即羊布魯菌(Brucellamelitensis)、牛布魯菌(B.abortus)、豬布魯菌(B.suis)、綿羊布魯菌(B.ovis)、犬布魯菌(B.canis)和沙林鼠布魯菌(B.neotomae)。此外，從田鼠中分離到了B.microti，從海洋動(dòng)物鯨和海豚中分別分離到了B.pinnipedialis和B.ceti，從病人乳房植入體中分離到了B.inopinata。其中牛、羊和豬種布魯菌最為常見，且羊布魯菌的侵染力與感染力最強(qiáng)，對(duì)人的危害也是最大的，其次是豬布魯菌、牛布魯菌和犬布魯菌。絕大多數(shù)人感染的布魯菌病由羊布魯菌引起[2-3]。

目前，已有多種布魯菌抗原被證明可以作為潛在的保護(hù)性抗原。L7/L12蛋白屬于核蛋白，為重要的免疫優(yōu)勢(shì)抗原，在布魯菌各菌株中具有高度的保守性[4]。其中，以L7/L12為基礎(chǔ)構(gòu)建的疫苗可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫，在小鼠感染模型中具有顯著的抵抗作用[5]。以布魯菌核糖體蛋白粗提物作為疫苗抗原的研究最早可追溯到20世紀(jì)70年代，而重組蛋白L7/L12的提取方法也在不斷改進(jìn)。司瑞等用原核表達(dá)載體pGEX-4T-1表達(dá)了L7/L12基因，用GSTrap FF親和層析法獲得了布魯菌重組蛋白L7/L12[6]。梁曉英等用原核表達(dá)載體pET-28a(+)構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-L7/L12，使用Ni-NTA親和層析法獲得了布魯菌重組L7/L12蛋白，且該重組蛋白以包涵體形式表達(dá)[7]。

本試驗(yàn)以布魯菌S2型減毒活疫苗基因組為模板，克隆其L7/L12基因，用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組L7/L12蛋白，并制備其多克隆抗體，以期為進(jìn)一步研究L7/L12蛋白對(duì)布魯菌感染的診斷方法和基因工程疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 布魯菌S2型減毒活疫苗，大腸埃希菌Top10、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，原核表達(dá)載體pET-28a(+)由上海市公共衛(wèi)生臨床中心病原細(xì)菌感染與免疫課題組保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Balb/c小鼠，雌性，6周齡～8周齡，體重20 g左右，購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，正常飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF級(jí)動(dòng)物房中。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；DNA Marker、PrimerSTAR GXL DNA聚合酶、dNTPs和蛋白質(zhì)Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；瓊膠糖凝膠回收試劑盒和小量細(xì)菌質(zhì)粒DNA抽提試劑盒為Axygent公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Abbkine公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光底物為Millpore公司產(chǎn)品；Ni-Bind Resin為GE Amersham公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中布魯菌L7/L12蛋白基因序列 (GenBank number:F362131.1) 設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物序列為：F:5′-GCGGATCCATGGCTGATCTCGCAAAGAT- CG-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)),R:5′-CCCTCGAGTTACTTGAGTTCAACCTTGGCG- C-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，預(yù)期擴(kuò)增的片段大小為375 bp，引物濃度為10 μmoL/L，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 L7/L12基因的擴(kuò)增及純化 以S2型減毒活疫苗基因組為模板，F(xiàn)、R為引物，PCR擴(kuò)增L7/L12基因完整編碼區(qū)片段，PCR反應(yīng)體系50 μL：Primer Star DNA酶1.5 μL，5×Primer Star buffer 10 μL，上、下游引物F/R各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，dNTPs 4 μL，ddH2O補(bǔ)足體系。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA膠回收純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將L7/L12基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pET-28a(+)載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，膠回收L7/L12基因片段和載體酶切產(chǎn)物，按照T4 DNA連接酶使用說(shuō)明書，于22℃連接1 h。將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Top 10感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含50 μg/mL卡那霉素(K+)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜。陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR篩選，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定正確后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-L7/L12。

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1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基(K+)，37℃培養(yǎng)過夜。次日菌液按1∶100接種于250 mL LB培養(yǎng)基(K+)，37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)3 h～4 h至OD600nm值為0.6左右。加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，37℃誘導(dǎo)3 h，離心收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，進(jìn)行150 g/L SDS-PAGE分析。

1.2.5 重組蛋白的純化 將重組表達(dá)菌大量培養(yǎng)并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，4℃離心收集菌體，菌體沉淀經(jīng)PBS洗滌2次，用25 mL PBS重懸菌體，在冰浴中進(jìn)行超聲破碎至菌體變清亮，4℃離心收集上清，將上清通過已平衡好的Ni2+NTA His Bind Resin柱，在重力作用下完全通過鎳柱后，用含20 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗脫目的蛋白，再用不同咪唑濃度(40、80、120、160、200、400 mmol/L)的洗脫緩沖液洗柱，收集洗脫的目的蛋白，進(jìn)行150 g/L SDS-PAGE分析。將純化的重組蛋白進(jìn)行透析，并用PEG 8000進(jìn)行濃縮，SDS-PAGE分析蛋白純度，BCA法測(cè)定蛋白濃度，置-80℃保存。

1.2.6 小鼠多克隆抗體的制備 將純化的布魯菌L7/L12蛋白皮下多點(diǎn)注射免疫Balb/c小鼠，免疫用量為25 μg/只，取純化的重組蛋白rL7/L12與完全弗氏佐劑1∶1乳化后進(jìn)行首次免疫，空白對(duì)照組注射等體積的PBS，14 d后取純化的重組蛋白與不完全弗氏佐劑等量乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫3次，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，最后1次免疫后的14 d，眼眶采血，3 000 r/min離心10 min分離血清，置-80℃保存。

1.2.7 小鼠多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定 用間接ELISA方法檢測(cè)L7/L12蛋白小鼠多克隆抗體效價(jià)：以純化后的L7/L12重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板，2 μg/孔，4℃包被過夜，一抗為不同稀釋倍數(shù)的L7/L12蛋白小鼠多克隆抗體，PBS組小鼠血清為陰性對(duì)照，1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光值。判定標(biāo)準(zhǔn)為：以PBS組小鼠血清為陰性對(duì)照，高于陰性血清OD450nm值2倍的最高血清稀釋度為抗體效價(jià)。

1.2.8 多克隆抗體的 Western blot分析 將純化的重組蛋白經(jīng)150 g/L SDS-PAGE分離后，將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入L7/L12蛋白小鼠多克隆抗體(1∶2 000稀釋)，4℃ 孵育過夜；用TBST緩沖液洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶8 000稀釋)，37℃孵育1 h；TBST洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光底物顯影，進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 L7/L12基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

L7/L12基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在375 bp處擴(kuò)增得到一條特異性條帶(圖1)，與預(yù)期大小一致。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.L7/L12 基因PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR products of L7/L12 gene

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-L7/L12，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見大小約5 300 bp(pET-28a(+))和375 bp(L7/L12基因)的2條特異性條帶，與預(yù)期目的條帶大小相符(圖2)。測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有的L7/L12基因序列(GenBank number:F362131.1)同源性達(dá)到100%，進(jìn)一步表明重組質(zhì)粒pET-28a-L7/L12構(gòu)建成功。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000; 1.pET-28a-L7/L12的BamHⅠ+XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物; 2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

M.DNA Marker DL 5 000; 1.Products from pET-28a-L7/L12 digested byBamHⅠ andXhoⅠ; 2.PCR product

圖2重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定

Fig.2 PCR and restriction enzyme digestion analysis of the
recombinant plasmid pET-28a-L7/L12

2.3 重組蛋白表達(dá)和純化產(chǎn)物的鑒定

重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體超聲破碎，菌體裂解液經(jīng)150 g/L SDS-PAGE分析，可見重組L7/L12蛋白在大腸埃希菌中高水平表達(dá)，分子質(zhì)量約為17 ku，且在咪唑濃度為160 mmol/L時(shí)rL7/L12蛋白條帶單一，蛋白純度最高(圖3)。經(jīng)BCA法測(cè)定，其蛋白濃度為0.715 mg/mL。

M.廣譜蛋白標(biāo)準(zhǔn); 1.pET-28a空載體; 2.未誘導(dǎo)的pET-28a-L7/L12全菌; 3.誘導(dǎo)后pET-28a-L7/L12菌體裂解上清; 4.誘導(dǎo)后pET-28a-L7/L12菌體裂解沉淀; 5.純化的重組L7/L12蛋白

M.Protein Marker; 1.pET-28a as control; 2.Total protein of pET-28a-L7/L12 without induction; 3.Supernatant of pET-28a-L7/L12 after induction; 4.Precipitate of pET-28a-L7/L12 after induction; 5.Purified rL7/L12 protein

圖3重組L7/L12蛋白表達(dá)及純化

Fig.3 Expression and purification of fusion L7/L12 protein

2.4 小鼠多克隆抗體的效價(jià)

將純化的重組L7/L12蛋白免疫組和PBS對(duì)照組血清進(jìn)行1∶1 000稀釋，2倍倍比稀釋后進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，按照陽(yáng)性血清與陰性血清D450nm值的比值(P/N)大于2的判定標(biāo)準(zhǔn)，L7/L12蛋白小鼠多克隆抗血清效價(jià)為1∶128 000，表明重組L7/L12蛋白具有良好的免疫原性(圖4)。

圖4 L7/L12蛋白多克隆抗體效價(jià)

2.5 多克隆抗體的Western blot分析

Western blot結(jié)果表明，本試驗(yàn)制備的小鼠多克隆抗體能與重組L7/L12蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，在大小約17 ku處可見一條特異性雜交條帶，且與PBS組小鼠血清反應(yīng)無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，說(shuō)明所制備的抗血清具有良好的反應(yīng)特異性(見圖5)。

M.預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn); 1.PBS組小鼠血清; 2.小鼠抗L7/L12蛋白多克隆抗體

M.Protein Marker; 1.Negative serum; 2.Polyclonal antibody against the L7/L12 protein

圖5多克隆抗體的Western blot分析

Fig.5 Western blot analysis of the polyclonal antibody

3 討論

布魯菌病最早在歐洲發(fā)現(xiàn)。1860年，Morston根據(jù)臨床特點(diǎn)、尸體剖檢結(jié)果等進(jìn)行分析研究，將其認(rèn)定為臨床上一種獨(dú)立的傳染病，命名為“地中海弛張熱”[8]。1886年，由David Bruce首次從一個(gè)死亡于“馬耳他熱”的士兵身上分離得到病原菌，后來(lái)證明為羊布魯菌[9]。此間，經(jīng)過人類不斷研究，完善了對(duì)該菌的認(rèn)識(shí)。布魯菌感染家畜和野生動(dòng)物時(shí)，主要引起妊娠母畜流產(chǎn)和公畜不育[10]。此外，該菌也嚴(yán)重威脅著人類的健康，人類感染布魯菌，可產(chǎn)生許多非特異性表癥，如間歇性發(fā)熱、出汗、寒顫、不適、惡心，還有厭食、頭痛、肌痛和背痛[11]。迄今為止，對(duì)于人布魯菌病還沒有可用的疫苗，有關(guān)疫苗的人體臨床試驗(yàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)也很少[12]。因此，為了研究安全有效的疫苗，深入了解布魯菌感染所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)和保護(hù)性機(jī)制是必不可少的。當(dāng)前研究表明，布魯菌感染后，機(jī)體可產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，主要通過誘導(dǎo)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞反應(yīng)或促炎性細(xì)胞因子，活化巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DCs)，從而增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)[13]。

L7/L12蛋白以4個(gè)拷貝形式存在于核糖體亞單位中，C端具有與EF-G和EF-Tu相結(jié)合的延伸因子，N端的二聚體與L10的核糖體蛋白結(jié)合，這種結(jié)構(gòu)有利于在GTP水解過程中獲取能量。研究發(fā)現(xiàn)，布魯菌L7/L12蛋白能夠特異性刺激感染動(dòng)物的單核細(xì)胞，上調(diào)IFN-γ的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用[14]。Oliveira J等[15]用原核表達(dá)載體構(gòu)建了L7/L12-BMP融合蛋白，腹腔注射免疫小鼠，免疫3次后以B.abortus攻毒，發(fā)現(xiàn)其保護(hù)效率可達(dá)到S19疫苗的一半。Mallick等將L7/L12核糖體蛋白進(jìn)行脂化形成一種牛布魯菌B-T細(xì)胞抗原，結(jié)果證明重組L7/L12蛋白的脂質(zhì)體形式大大提高了重組蛋白的免疫原性，能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，且其攻毒保護(hù)效果也明顯增加[16]。Singh D等[17]用PLGA(85∶15)納米粒在小鼠體內(nèi)遞呈rLl7/L12，結(jié)果表明用這種納米載體可以抗B.abortus544感染，可替代傳統(tǒng)蛋白佐劑。Luo D等[18]研制了能同時(shí)表達(dá)布魯菌L7/L12蛋白和Omp16蛋白的二價(jià)DNA疫苗，該二價(jià)疫苗能夠刺激T淋巴細(xì)胞的大量增殖與IFN-γ產(chǎn)生，誘導(dǎo)更強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，且其保護(hù)水平明顯高于單個(gè)抗原。Tabynov K等[19]首次構(gòu)建了以流感病毒為載體編碼布魯菌L7/L12蛋白的疫苗，該載體疫苗可以提供與商品化疫苗B.abortusS19和B.abortusRB51相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)效果。Du Z Q等[20]以布魯菌rL7/L12-BLS免疫家兔檢測(cè)其免疫原性，結(jié)果表明該融合蛋白可誘導(dǎo)高水平的IgG，且rL7/L12-BLS組和rL7/L12組IFN-γ含量顯著上調(diào)。因此，L7/L12作為一種優(yōu)秀的T細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)抗原，可作為潛在的布魯菌疫苗候選分子。

本試驗(yàn)用pET-28a原核表達(dá)載體高效表達(dá)了布魯菌L7/L12重組蛋白，通過Ni-NTA親和層析法獲得了高純度的布魯菌重組L7/L12蛋白。SDS-PAGE分析表明布魯菌L7/L12蛋白未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)也可大量表達(dá)，且存在可溶和包涵體兩種形式，為蛋白的進(jìn)一步純化和性質(zhì)鑒定提供了基礎(chǔ)材料。Western blot分析顯示，該重組蛋白能與布魯菌rL7/L12免疫小鼠血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明L7/L12的結(jié)構(gòu)在大腸埃希菌中得到了正確折疊，其免疫學(xué)活性沒有受到影響，且特異性強(qiáng)。間接ELISA也證明了布魯菌L7/L12蛋白具有良好的抗原性，是一種重要的布魯菌診斷抗原和疫苗后選分子。綜上所述，本研究成功制備了純化的重組L7/L12蛋白和小鼠抗L7/L12蛋白多克隆抗體，為下一步比較布魯菌DNA疫苗和重組蛋白亞單位疫苗的免疫效果提供了材料，為進(jìn)一步研究L7/L12蛋白對(duì)布魯菌感染的診斷方法和基因工程疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。