龔小程，胡傲雪，李雪鵬，吳中興，何 駿，郭少敏，寧蓬勃*

(1.西安電子科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西西安 710071；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)校醫(yī)院，陜西楊凌 712100)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種具有高度傳染性和致死性的疾病，嚴(yán)重影響世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。豬瘟病毒石門株(CSFV Shimen)是經(jīng)典強(qiáng)毒株，可以逃避宿主免疫監(jiān)控并建立持續(xù)侵染[2]，引起出血性淋巴結(jié)炎，皮膚、腎等器官的彌散性出血以及高熱、抑郁等發(fā)病癥狀[3]。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)CSFV Shimen的侵染機(jī)制研究已取得一定進(jìn)展，其深層次的致病機(jī)制仍需深入探究。

以往針對(duì)病毒與宿主細(xì)胞的互作機(jī)制研究工作，常依賴“文獻(xiàn)學(xué)習(xí)”方法來(lái)提示可能的互作基因，以致創(chuàng)新能力有限。近年來(lái)，高通量測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的組學(xué)研究技術(shù)，為系統(tǒng)全面地解讀CSFV的侵染機(jī)制提供了可能。同時(shí)，隨著測(cè)序成本的降低，如何在日益豐富的多組學(xué)大數(shù)據(jù)中有效挖掘關(guān)鍵信息，這對(duì)研究者提出了新的思考。

巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成成分，在非特異性防御、抗原呈遞和炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[4]。血管內(nèi)皮細(xì)胞參與血管多方面的生理功能調(diào)節(jié)，在急性炎癥的情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增加可導(dǎo)致組織的水腫或腫脹。巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞作為豬瘟病毒的主要靶細(xì)胞，已為國(guó)內(nèi)外研究者所關(guān)注。本課題組前期采用CSFV Shimen分別侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)及豬臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(swine umbilical vein endothelial cells,SUVEC)，應(yīng)用高通量測(cè)序分析技術(shù)分別獲得CSFV Shimen侵染PAMs和SUVEC后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)[5-6]。在解讀CSFV Shimen對(duì)不同宿主細(xì)胞形成特異性侵染應(yīng)答機(jī)制的同時(shí)，也考慮到CSF作為全身多組織臟器損傷的烈性傳染病，CSFV Shimen 對(duì)不同宿主細(xì)胞的侵染機(jī)制也必定存在共性作用機(jī)制。這種共性作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)將更有助于系統(tǒng)闡明CSF內(nèi)在的發(fā)病機(jī)制。為此，本研究對(duì)已有兩種細(xì)胞系的差異表達(dá)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，深度挖掘分析CSFV Shimen侵染PAMs及SUVEC后宿主共性的關(guān)鍵應(yīng)答基因，研究結(jié)果可為CSFV與宿主細(xì)胞之間的分子相互作用研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料

CSFV Shimen，獸醫(yī)生物制品和藥物控制研究所產(chǎn)品(中國(guó)北京)，PAMs 3D4/21(CRL-2843)，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心產(chǎn)品(Manassas,VA,USA)[7]，SUVEC取自豬臍帶靜脈，構(gòu)建的傳代細(xì)胞系[6]。

1.2 方法

1.2.1 關(guān)聯(lián)分析 CSFV Shimen侵染以及Mock對(duì)照的PAMs和SUVEC提取RNA并完成高通量測(cè)序，采用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)，獲得CSFV Shimen侵染條件下，PAMs和SUVEC以及對(duì)照組在轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)的基因[5-6]。在本研究中，我們將PAMs與SUVEC的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate，F(xiàn)DR)≤0.001且倍數(shù)差異在2倍及以上的基因定義為差異表達(dá)基因；將兩數(shù)據(jù)庫(kù)中共同表達(dá)的基因相關(guān)聯(lián)；遴選共同上調(diào)或共同下調(diào)表達(dá)的差異基因作為研究目標(biāo)，以更準(zhǔn)確解讀CSFV Shimen侵染的典型機(jī)制。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 Gene ontology(GO)是在生物信息學(xué)中對(duì)基因和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行限定和描述的分析工具，涵蓋細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物過(guò)程(biological process,BP)三個(gè)方面。通過(guò)DAVID對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，其中P<0.05的GO術(shù)語(yǔ)被認(rèn)為是顯著性富集。KEGG是在分子水平解讀基因或蛋白質(zhì)之間交互(互動(dòng))網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，同樣通過(guò)DAVID對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，其中P<0.05的KEGG術(shù)語(yǔ)被認(rèn)為是顯著性富集。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 13.0(SPSS，Chicago，IL)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)被控制在0.001以下的認(rèn)為其具有顯著性意義，并且通過(guò)t檢驗(yàn)來(lái)檢查平均值之間的差異。當(dāng)P<0.05時(shí)被認(rèn)為是具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 PAMs與SUVEC的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)共同表達(dá)的差異基因

將CSFV Shimen侵染PAMs后得到的顯著差異表達(dá)基因2649個(gè)，以及侵染SUVEC得到的顯著差異基因658個(gè)，分別進(jìn)行聚類分析。其中PAMs數(shù)據(jù)庫(kù)中得到上調(diào)基因1303個(gè)，下調(diào)基因1346個(gè)；SUVEC數(shù)據(jù)庫(kù)中得到上調(diào)基因262個(gè)，下調(diào)基因396個(gè)。進(jìn)一步將兩組數(shù)據(jù)分別關(guān)聯(lián)，對(duì)得到的兩組上調(diào)基因及兩組下調(diào)基因分別取其交集，最終得到兩種細(xì)胞系共有的同趨勢(shì)差異表達(dá)基因，其中共同上調(diào)基因有39個(gè)，共同下調(diào)的基因有77個(gè)(圖1)。表1結(jié)果提示，與宿主細(xì)胞生命活動(dòng)密切相關(guān)的部分基因，例如：真核翻譯起始因子4A3(EIF4A3)、蛋白酶體β亞基3型(PSMB3)、谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶2(GOT2)、微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3A(MAP1LC3A)、磷脂酶D3(PLD3)、ATP依賴性染色質(zhì)重塑劑SMARCA4(SMARCA4)、蛋白酶體α亞基6型(PSMA6)、CDC28蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基1B(CKS1B)、泛素綴合酶E2變體1(UBE2V1)，在兩組數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)了共同下調(diào)，而酪氨酸蛋白磷酸酶非受體2型(PTPN2)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基中間隔蛋白2(ERGIC2)等基因則出現(xiàn)了共同上調(diào)表達(dá)。

上面2個(gè)代表了SUVEC和PAMs上調(diào)的基因，下面2個(gè)代表了兩種細(xì)胞下調(diào)的基因

Top two represent up-regulated genes in vascular endothelial cells and macrophages,respectively.Two down represent down-regulated genes in both cells

圖1 CSFV Shimen侵染PAMs與SUVEC
中差異表達(dá)基因數(shù)量

Fig.1 Coexpression analysis of macrophages and endothelial
cells infected with CSFV Shimen

2.2 GO與KEGG分析

為了探明與CSFV Shimen侵染相關(guān)基因表達(dá)變化的可能結(jié)果，基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)侵染了CSFV的PAMs和SUVEC具有相同變化趨勢(shì)的差異基因進(jìn)行了GO分析。結(jié)果顯示,CSFV Shimen侵染在分子功能和細(xì)胞組分變化相關(guān)的系列生物過(guò)程中引起了PAMs基因的異常表達(dá)。如圖2所示，CSFV Shimen侵染不僅可以影響細(xì)胞的翻譯起始過(guò)程、核轉(zhuǎn)錄的mRNA分解過(guò)程，影響琥珀酸代謝過(guò)程以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等等。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)這些差異基因大多數(shù)被富集在了與NF-κB有關(guān)的信號(hào)通路中，提示了CSFV Shimen感染過(guò)程中炎性發(fā)展機(jī)制的關(guān)鍵所在。

為了進(jìn)一步闡明與CSFV Shimen侵染相關(guān)的差異表達(dá)基因的功能作用，基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)同樣針對(duì)侵染了CSFV的PAMs和SUVEC具有相同變化趨勢(shì)的差異基因進(jìn)行了KEGG分析(圖3)。顯著性的KEGG通路包含抗生素的生物合成、RNA運(yùn)輸、DNA復(fù)制、蛋白酶體、碳代謝等通路。這些通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、生物合成及代謝息息相關(guān)，提示了CSFV Shimen與宿主細(xì)胞相互作用以維持感染穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制。

表1 CSFV Shimen侵染后PAMs與SUVEC共表達(dá)的同趨勢(shì)關(guān)鍵基因

不同的顏色代表富集在生物過(guò)程中的不同GO術(shù)語(yǔ)，扇形區(qū)域的大小代表了富集在相應(yīng)術(shù)語(yǔ)中的基因數(shù)目所占比例的大小

Different colors represent different GO terms enriched in biological processes,and the size of the fan-shaped region represents the proportion of genes enriched in the corresponding terms

圖2共表達(dá)差異表達(dá)基因的GOBP富集分析

Fig.2 GO-BP enrichment analysis of co-expressing differentially expressed genes

橫坐標(biāo)為P值的負(fù)對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為KEGG通路名稱

The abscissa is the negative logarithm of the P value and the ordinate is the KEGG pathway name

圖3共表達(dá)差異基因的pathway富集分析

Fig.3 Pathway enrichment analysis of co-expression
of differential genes

3 討論

豬瘟是豬最嚴(yán)重和易感染的疾病之一，對(duì)全球畜牧業(yè)產(chǎn)生了非常嚴(yán)重的影響，其發(fā)病機(jī)制是仍是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。應(yīng)用基因芯片技術(shù)，Gladue DP等人在CSFV Brescia 侵染48 h后的巨噬細(xì)胞中辨明48個(gè)上調(diào)及31個(gè)下調(diào)基因，以理解其免疫應(yīng)答機(jī)制；Li J等人對(duì)CSFV Shimen感染后獲得的單核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)分析，獲得了免疫、凋亡、周期等相關(guān)的系列基因[8]。這些研究雖已嘗試在組學(xué)層面解讀CSF發(fā)病機(jī)制，但前期研究?jī)H針對(duì)單一細(xì)胞系進(jìn)行分析，不利于系統(tǒng)闡明整體發(fā)病機(jī)制。

本研究中基于高通量測(cè)序結(jié)果[5-6]開(kāi)展雙細(xì)胞組學(xué)關(guān)聯(lián)分析，為挖掘宿主與病毒互作的調(diào)控基因提供了新思路。s本研究發(fā)現(xiàn)(表1)，PSMB3、PSMA6作為顯著下調(diào)蛋白出現(xiàn)在關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)組中。PSM是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的重要組成元件[9]，而UPS參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、及免疫反應(yīng)等重要生理過(guò)程，動(dòng)脈粥樣硬化、帕金森綜合癥、癌癥等某些重大疾病的內(nèi)在聯(lián)系即是UPS功能紊亂。CSF作為病毒性疾病，UPS功能紊亂有可能是其內(nèi)在病因之一。CKS1的代謝可減慢細(xì)胞周期G1期的進(jìn)程，是乳腺癌病程中的關(guān)鍵因子；而PTPN2能調(diào)節(jié)干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]，CSFV有可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞的周期及凋亡產(chǎn)生影響，從而為自身復(fù)制提供時(shí)間及空間。與此同時(shí)，PLD3參與神經(jīng)發(fā)生的后期階段，促成與神經(jīng)傳遞、靶細(xì)胞神經(jīng)支配和神經(jīng)元存活等關(guān)鍵進(jìn)程，該類基因的下調(diào)表達(dá)提示了豬瘟病程中精神沉郁等病理性神經(jīng)癥狀的可能發(fā)生機(jī)制。

基于對(duì)雙細(xì)胞系共表達(dá)差異基因的GO分析，我們對(duì)CSFV Shimen的侵染機(jī)制有了更明確的理解。GO分析顯示共表達(dá)基因主要富集在NF-κB相關(guān)的通路中(圖2)。NF-κB不僅在調(diào)節(jié)病毒侵染引起的免疫應(yīng)答過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，而且在病毒持續(xù)感染中，持續(xù)激活NF-κB可致宿主細(xì)胞發(fā)生致癌轉(zhuǎn)化。HIV-1的復(fù)制依賴NF-κB介導(dǎo)[11]，HIV-1糖蛋白gp41與其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合通過(guò)TGF-β誘導(dǎo)NF-κB激活[12]，NF-κB則刺激HIV-1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)病毒復(fù)制。研究顯示，低NF-κB活性的細(xì)胞對(duì)流感病毒侵染具有抗性，但是在NF-κB活化后卻變得敏感，這也提示能夠通過(guò)阻斷NF-κB的激活來(lái)抑制流感病毒侵染。丙型肝炎病毒可通過(guò)NF-κB/miR-503/bcl-2通路來(lái)阻斷細(xì)胞凋亡[13]。更重要的是，Ling S等[14]發(fā)現(xiàn)，豬瘟病毒NS5A蛋白能夠與Hsp27細(xì)胞相互作用并通過(guò)NF-κB信號(hào)通路對(duì)病毒復(fù)制進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。以上研究明確了NF-κB及其相關(guān)通路與病毒侵染的關(guān)系，有力地支持了我們的分析結(jié)果。

大多數(shù)病毒如腺病毒、皰疹病毒、痘病毒等的侵染均能對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的生物合成等生物學(xué)過(guò)程產(chǎn)生一定影響[15]，KEGG的結(jié)果同樣驗(yàn)證了豬瘟病毒的侵染能夠通過(guò)改變生物合成代謝，從而為自身的復(fù)制與傳播提供可能。

綜上所述，我們系統(tǒng)比較了CSFV Shimen侵染PAMs和豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系中共表達(dá)差異基因，并通過(guò)生物信息學(xué)方法解讀了CSFV Shimen侵染的共性調(diào)控關(guān)系。這些數(shù)據(jù)為理解CSFV Shimen侵染宿主細(xì)胞最終導(dǎo)致豬瘟形成提供了新的視角，為繼續(xù)深入研究發(fā)病機(jī)制提供了有價(jià)值的科學(xué)信息。