薛濤 趙晗 徐國敬 許崇新 王瑞松 （山東省莒縣店子集畜牧獸醫(yī)站 276522）

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日照地區(qū)某雞場雞源性大腸桿菌的分離培養(yǎng)及藥敏試驗

薛濤 趙晗 徐國敬 許崇新 王瑞松 （山東省莒縣店子集畜牧獸醫(yī)站 276522）

本試驗的目的在于研究禽類體內(nèi)的大腸桿菌的分離鑒定并對分離出來的大腸桿菌進行藥敏試驗來分析耐藥性。本試驗對采集到的某養(yǎng)殖場的20份泄殖腔拭子進行分離鑒定，革蘭氏染色，確定了16株大腸桿菌，采用NCCLs推薦的紙片擴散法(Kirby Bauer氏法)對其進行了9種藥敏試驗，雞源大腸桿菌對頭孢噻肟、慶大霉素敏感，對氧氟沙星、阿莫西林中度敏感，對多環(huán)丙沙星、恩諾沙星、萘啶酸、四環(huán)素、復方新諾明已產(chǎn)生了耐藥性。結(jié)果可對禽類大腸桿菌病臨床合理用藥具有指導意義。

雞 大腸桿菌 分離鑒定 藥敏試驗

近幾年，隨著國家經(jīng)濟水平的穩(wěn)步增長，人們消費水平的提高，對于肉蛋奶用量的需求量逐步增加。相對應的畜牧行業(yè)的發(fā)展也逐步加快，禽類農(nóng)產(chǎn)品占有一定比例。禽類的腸道內(nèi)含有大腸桿菌，但能夠引起禽類致病的是具有毒力的菌株稱為致病性大腸桿菌。致病性大腸桿菌成為近來危害禽類主要的細菌性疾病，給禽類生產(chǎn)造成損失[1]。

大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli，又稱大腸埃希氏菌)是由德國Escherich于1885年首次從嬰兒糞便中分離得到的，是人類和動物臨床上重要的致病菌，是近年來食品衛(wèi)生、用水衛(wèi)生及流行病學領(lǐng)域的研究對象之一[2]。它是革蘭氏陰性菌，單一或成對存在，多為桿狀，無芽孢，兩端鈍圓，多有鞭毛，能運動，有的還含莢膜。大腸桿菌屬于兼性厭氧菌，最適合的生長條件為37℃和pH 7.2~7.4[3]。致病性大腸桿菌根據(jù)不同的生物學特性可分為5類：腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性大腸桿菌(EAEC)。該菌對熱的抵抗力較強，55℃加熱60min或60℃加熱15min部分細菌仍能存活。在自然界的水中可存活較長時間，該菌在溫度較低的糞便中能存活數(shù)月。大腸桿菌能合成維生素B和維生素K，正常棲居條件下不致病；若進入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在水和食品中檢出，可認為是被糞便污染的指標[4]。根據(jù)O、K、H抗原的不同，可將大腸桿菌菌株分為不同的血清型。一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，尤其對嬰兒和幼畜(禽)，常引起嚴重腹瀉和敗血癥。

大腸桿菌的臨床癥狀不太明顯，由于致病性大腸桿菌類型的不同和雞的生長期、生理機能和免疫狀態(tài)等的差異，發(fā)生的疾病也有所不同。從20世紀60年代開始就被Gross 、Smith 和 Nakamura等人依次證實[5]，臨床上有以下幾種表現(xiàn)型:急性敗血型、內(nèi)臟型、大腸桿菌性肉芽腫、神經(jīng)型(腦炎型)、關(guān)節(jié)炎或足墊腫型、生殖型(輸卵管炎和卵黃性腹膜炎型)。其中這些表現(xiàn)型中危害最嚴重的是急性敗血型和生殖型(輸卵管炎和卵黃性腹膜炎)。并且多并發(fā)或繼發(fā)于其它病毒性或細菌性疾病[6-7]，如繼發(fā)于新城疫或傳染性支氣管炎。

在日照地區(qū)，畜禽的飼養(yǎng)過程中，養(yǎng)殖戶會大量使用抗生素進行疾病的治療和增強免疫力，而這個過程往往造成了大腸桿菌在藥物的選擇壓力作用下，產(chǎn)生耐藥性，使疾病更加難以治療。由于雞的大腸桿菌病在臨床上頻發(fā)，其不分日齡，不分季節(jié)的流行特點和病程較長的發(fā)病特點給養(yǎng)殖戶造成了很大困擾，許多人容易病急亂投醫(yī)，可能造成適得其反的效果。這些都表明養(yǎng)殖上需要科學的理論依據(jù)作指示，本論文對日照地區(qū)某雞場雞源性大腸桿菌進行了生化鑒定和藥敏試驗，為了掌握該雞場大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀，旨在為指導該雞場臨床科學、合理、有效用藥，防治大腸桿菌感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 日照地區(qū)部分規(guī)模化養(yǎng)雞場泄殖腔拭子。

1.1.2 試劑 營養(yǎng)瓊脂、LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(Maconkey Agar)為北京路橋技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品；三糖鐵瓊脂為青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨水、葡萄糖磷酸鹽胨水、枸櫞酸鹽均、硫化氫為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片(阿莫西林，四環(huán)素，慶大霉素，頭孢噻肟，氧氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，萘啶酸，復方新諾明)為杭州天和微生物劑有限公司產(chǎn)品；細菌微量生化反應管、95%乙醇、30%甘油、草酸銨結(jié)晶紫溶液、革蘭氏碘溶液、石炭酸復紅、0.9%生理鹽水等試劑。

1.1.3 儀器 光學顯微鏡、分光光度計(上海躍進醫(yī)療器械一廠)、萬用電爐(龍口市先科儀器公司)、生物潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS-60X75-B上海躍進醫(yī)療器械廠)、電子天平(上海躍進醫(yī)療器械一廠)、ZDX-35BI座式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)、DHG—9023A箱電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司)。

1.1.4 培養(yǎng)基的配置 （1）LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：取25.0g溶解于1000ml蒸餾水中，加入20%~30%的甘油，用玻璃棒攪拌加熱至溶解，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。（2）麥康凱瓊脂：取55.0g溶于1000ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，115℃高壓滅菌20min備用。（3）三糖鐵瓊脂(TSI)培養(yǎng)基：將64.5g溶于1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，121 ℃高壓滅菌15 min，制成高層斜面?zhèn)溆?。?）營養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar)：取33.0g于1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15min，冷卻至46℃左右制成平板或者斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 采樣 用滅菌的棉簽緩緩插入雞的泄殖腔內(nèi)，旋轉(zhuǎn)數(shù)下，然后將其放入滅菌的裝有生理鹽水和LB肉湯的10ml離心管內(nèi)，折斷手持部分，做好標記，放入冰盒保存。

1.2.2 細菌的分離與培養(yǎng) 在超凈工作臺內(nèi)點燃酒精燈對工作臺進行消毒，將裝有棉拭子的離心管放到37℃恒溫箱內(nèi)解凍。在酒精燈火焰附近用接種環(huán)沾取菌液接種到麥康凱培養(yǎng)基內(nèi)，采取三區(qū)劃線法接種細菌，注意不要劃破瓊脂表面。接種完后放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑取培養(yǎng)基上畫線區(qū)線上生長較好的單菌落，接種到營養(yǎng)瓊脂上。將營養(yǎng)瓊脂放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18h。

1.2.3 細菌的純化與保存 用接種環(huán)從培養(yǎng)基畫線上挑取粉紅色生長較好的單個菌落接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)16~18h。用封口膜封好縫隙，放入冰箱內(nèi)低溫保存，以備后用。在滅菌的離心管內(nèi)加入1000μl的營養(yǎng)肉湯，用滅菌的棉簽涂抹營養(yǎng)瓊脂上的菌落混入肉湯中，用封口膜封口，標簽紙寫上編號，放入冰箱內(nèi)低溫保存。

1.2.4 細菌的革蘭染色及鏡檢 取干凈無油漬的載玻片，通過火焰過火，確保載玻片滅菌干凈。用滅菌接種壞取少量生理鹽水，至于玻片中央，接著用接種環(huán)挑取一個大腸桿菌單菌落于生理鹽水中攪勻，均勻涂成大小合適的薄層。自然晾干并用火焰固定。初染，將草酸銨結(jié)晶紫溶液滴加于干燥、固定好的抹片上，放置1~2min后水洗干凈；媒染，滴上革蘭氏碘溶液，在2~3min后水洗干凈；然后用95%乙醇進行脫色，在1min后進行水洗；繼續(xù)用石炭酸復紅進行復染，過3min后用水洗干凈；最后經(jīng)過自然晾干后，再進行鏡檢，即可觀察視野中細菌的形態(tài)。

1.2.5 細菌的生化鑒定 將所保存的菌放入37℃恒溫箱內(nèi)解凍，用無菌接種環(huán)接菌到生化管內(nèi)和三糖鐵斜面上。三糖鐵瓊脂接種先涂布斜面后穿刺底部，放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18h。觀察各生化管顏色變化。當生化試管變色后，取出蛋白胨水和葡萄糖磷酸鹽胨水，在蛋白胨水內(nèi)加入先加入乙醚再加入吲哚。葡萄糖磷酸鹽胨水用VP(Voges-Proskauer)法，先加入甲液(6%甲萘酚酒精溶液)再加入乙液(40%氫氧化鉀)。

1.2.6 細菌的藥敏試驗 在超凈工作臺內(nèi)配得菌液于離心管中。利用紫外分光光度計將菌液濃度調(diào)至108cfu/ml。采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗[8]。將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板用記號筆標記劃分為四區(qū)。用微量移液器吸取菌液100μl，小心滴于培養(yǎng)基表面中央位置。用無菌涂布棒，將沿一個方向?qū)⒕和坎加谂囵B(yǎng)基平面，改變原來的方向沿垂直方向來回推動涂布，重復多次使菌液分布均勻。室溫下靜置5~10min，使菌液浸入培養(yǎng)基內(nèi)。用無菌小鑷子分別夾住環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、萘啶酸、頭胞噻肟、四環(huán)素、慶大霉素、復方新諾明、阿莫西林藥敏片的邊緣按一定的布局貼在相應區(qū)域的中間位置。輕輕按壓使其固定，藥敏紙片一旦接觸平板就不可再移動。作好記錄后置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)18~24h。通過抑菌直徑來評定抑菌效果。直徑越大說明該藥物對菌株的抑菌效果好，菌株對該藥物敏感。測量抑菌圈直徑，取其平均值。不同藥物的判定標準參照臨床和實驗室標準化研究所(CLSI)推薦的標準[9]，見表1。

表1 各種抗菌藥物紙片含藥量及藥敏試驗結(jié)果判定標準

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的生化試驗結(jié)果

大腸桿菌能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖均產(chǎn)酸。MR試驗結(jié)果菌株均為陽性，吲哚試驗為陽性，VP試驗結(jié)果為陰性，TSI試驗為陽性，枸櫞酸鹽試驗為陰性，表示不能利用枸櫞酸鹽。TSI試驗陽性，斜面和底層均為黃色，底部有氣泡產(chǎn)生，確定的為4、6、9、10不是大腸桿菌。結(jié)果表2。

表2 細菌生化鑒定結(jié)果

注：“＋”陽性反應，“－”陰性反應，“⊕”陽性產(chǎn)氣

2.2 細菌分離率

通過分離培養(yǎng)，20份樣品中分離出16株大腸桿菌，細菌分離率為80%。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

對20株菌株進行藥敏試驗，由表3的數(shù)據(jù)與表1結(jié)合起來得到表4，根據(jù)判定標準為耐藥率=耐藥菌株數(shù)／測量菌株數(shù)×100%，敏感率=敏感菌株數(shù)／測量菌株數(shù)×100%[9]，由此可知菌株對四環(huán)素(60%)耐藥，大部分對環(huán)丙沙星(50%)、恩諾沙星(50%)、萘啶酸(64.3%)、復方新諾明(61%)耐藥；對頭孢噻肟(92%)、慶大霉素(81%)高度敏感。

表3 藥敏試驗結(jié)果 (mm)

表4 藥敏試驗結(jié)果分析

3 討論

3.1 細菌分離培養(yǎng)及鑒定分析

（1）通過細菌分離培養(yǎng)，雞源大腸桿菌在在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色菌落。對純化后的細菌進行革蘭氏染色，染色后為紅色，生物顯微鏡下觀察細菌形態(tài)為短小的桿狀，多單個存在，少數(shù)成對出現(xiàn)。通過以上結(jié)果可初步確定所鑒定菌種為革蘭氏陰性桿狀菌。對純化好的細菌進行生化鑒定試驗。因為不同種類的細菌對糖的分解利用能力不同，糖發(fā)酵試驗以能否分解某種糖，是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣等現(xiàn)象來鑒別細菌[10]。大腸桿菌能分解葡萄糖、麥芽糖和乳糖，產(chǎn)酸。本糖發(fā)酵試驗中葡萄糖、麥芽糖均為陽性，乳糖有2株菌株為陰性，其余大多數(shù)為陽性，屬于正常情況，可視其結(jié)果為陽性。大腸桿菌不能利用枸櫞酸鹽，故在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基仍為綠色。本枸櫞酸鹽利用實驗有一株菌株的結(jié)果為陽性，其他均為為陰性，可能是操作過程中污染了雜菌的原因。吲哚Indor試驗、MR試驗結(jié)果過均為陽性，VP試驗結(jié)果均為陰性，TSI試驗有2株為陰性，其他為陽性，視其結(jié)果為陽性。生化鑒定試驗的結(jié)果符合大腸桿菌的生化特性，進一步確定所鑒定的樣品為大腸桿菌。（2）在試驗過程中有時會因為操作步驟的不規(guī)范產(chǎn)生一些雜菌，這主要因素有以下幾點：①倒培養(yǎng)基時，錐形瓶的瓶口與培養(yǎng)皿壁有接觸，手碰觸培養(yǎng)皿的邊緣，使雜菌粘到錐形瓶瓶口處，導致錐形瓶內(nèi)的培養(yǎng)基被污染。②在使用生物潔凈工作臺時，沒有先開紫外燈滅菌直接進行接菌操作，使空氣中的雜菌落入培養(yǎng)基內(nèi)，影響試驗結(jié)果。③在進行保菌處理使用移液器時，移液槍頭碰到已經(jīng)高壓滅菌的離心管的管壁，污染了保存的菌液。在進行生化試驗時，加入試劑的時間長短，可以影響生化試驗結(jié)果的顯示。如在做VP試驗時，加入試劑5min內(nèi)生化管上部分會變成黑色，等到15min之后生化管呈現(xiàn)粉紅色，在1h后生化管呈現(xiàn)橘紅色。在不同時間段內(nèi)，生化管的顏色變化就給試驗結(jié)果的判定帶來了影響。根據(jù)試驗結(jié)果來看，分離出的菌株的生化試驗結(jié)果多為陽性，且符合大腸桿菌的生化特性，所以可以判定為分離出的18株菌株為大腸桿菌。

3.2 藥敏試驗耐藥性的分析

（1）由藥敏試驗結(jié)果表3、表4可知從20株菌株中分離出的16株菌株對環(huán)丙沙星耐藥率50%、中介率14.3%、敏感率35.7%，恩諾沙星耐藥率35.7%、中介率28.6%、敏感率35.7%，氧氟沙星耐藥率14.3%、中介率14.3%、敏感率74.1%，萘啶酸耐藥率64.3%、中介率14.3%、敏感率21.4%，頭孢噻肟耐藥率0%、中介率14.3%、敏感率85.7%，四環(huán)素耐藥率57.1%、中介率為21.4%、敏感率為21.4%，慶大霉素耐藥率7.1%、中介率14.3%、敏感率78.6%，復方新諾明耐藥率57.1%、中介率28.6%、敏感率14.3%，阿莫西林耐藥率28.6%、中介率7.1%、敏感率64.3%。由此可以看出來14株雞源大腸桿菌菌株全部對頭孢噻肟慶大霉素高度敏感，對其他藥物都有一定的耐藥性，其中對氧氟沙星、復方新諾明、阿莫西林較敏感。從表3還可以知道，大多數(shù)菌株對所有藥物都有一定的耐藥性，即表現(xiàn)為不同的多重耐藥現(xiàn)象，還有交叉耐藥現(xiàn)象。（2）從結(jié)果可以看出來，雞源大腸桿菌對臨床上較少使用的藥物較敏感，較多使用的藥物有耐藥性，而且對廣譜抗菌藥的耐藥性也在增加。這說明大腸桿菌對藥物的適應能力越來越強，產(chǎn)生耐藥性的速度也越來越快。所以臨床使用藥物時不能為了提高抗生素的治療效果就頻繁的換藥，另外從交叉耐藥上這一點來看不能隨便將幾種藥物混合使用。正是因為在實際藥物應用的時候沒有按照藥物規(guī)范標準使用，才使得應用時藥物劑量不足，或者為了防止某些禽類疾病隨便往禽類適量里添加抗菌藥物，從而導致禽類體內(nèi)的大腸桿菌對某些藥物出現(xiàn)耐藥性。（3）隨著我國養(yǎng)禽業(yè)現(xiàn)代化、集約化的發(fā)展，大量的抗菌藥物被投用于作為細菌感染的首選藥物，抗菌藥物的不合理使用和濫用的情況嚴重，導致家禽體內(nèi)和飼養(yǎng)環(huán)境中的大腸桿菌的耐藥性逐漸升高，藥物的作用能力逐漸降低，養(yǎng)殖場只能延長藥物使用的時間、加大投放藥物的劑量和選擇更新的藥物(頭孢類)解決藥力降低的問題，導致大腸桿菌在大強度的抗菌藥物壓力作用下，產(chǎn)生更高的耐藥性，甚至出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象。當前部分養(yǎng)殖場，為了節(jié)約飼養(yǎng)成本，多數(shù)在飼料和飲用水中加入抗生素來預防疾病的發(fā)生，但這種盲目的防治措施恰恰增大了細菌耐藥性產(chǎn)生的可能。目前研究最多的是食源性家畜和家禽，從食源性動物中分離的大腸桿菌可能是耐藥因子在人體和環(huán)境互相轉(zhuǎn)移的重要媒介，當食源性的耐藥菌轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，會對人的健康造成威脅。

本試驗結(jié)果和研究資料表明，大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象已經(jīng)非常普遍，應當加強這方面措施控制耐藥性升高的趨勢。首先在對禽類進行藥物使用之前，應該進行藥物的敏感性分析，禁止濫用藥物。依據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇使用相應的抗菌類藥物，并且要嚴格按照說明來決定使用劑量的多少，從而降低雞源大腸桿菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的幾率。另外，臨床用藥時也可與其他藥物配伍使用，多采用聯(lián)合用藥、交叉用藥等方式，從而來提高抗生素的治療效果。同時也可以用中藥來進行輔助，中藥具有毒副作用小，無耐藥性產(chǎn)生等優(yōu)點。

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（2018–6–20）

S852.61+2

A

1007-1733(2018)06-0008-04