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        乙?;疶LR4在GDM孕婦外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及意義

        2018-12-21 04:41:10周愛芬
        關(guān)鍵詞:乙酰化單核細(xì)胞孕婦

        周愛芬

        (許昌市立醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 許昌 461000)

        近年來(lái)妊娠期糖尿病 (gestational diabetes mellitus,GDM)的發(fā)病率一直處于高位并常伴有多項(xiàng)并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅了母嬰的身體健康,故而,研究GDM的相關(guān)機(jī)制對(duì)其早期診斷并給予恰當(dāng)?shù)闹委熅哂兄匾饬x,也是目前臨床研究的重要方向[1]?,F(xiàn)階段的研究[2]認(rèn)為GDM的主要病因是胰島素抵抗(insulin resistant,IR)和胰島功能受損。研究[3]已證實(shí)GDM孕婦體內(nèi)抗炎-致炎失衡、慢性炎癥狀態(tài)和 Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)途徑等參與了IR和胰島功能受損的形成過(guò)程并認(rèn)為TLR4過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致的機(jī)體異常炎癥反應(yīng)狀態(tài)已成為多項(xiàng)炎癥性疾病的病理基礎(chǔ)。

        先前的研究[4]發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素(lipopo-lysaccharide,LPS)-Toll樣受體4(TLR4)-核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路激活誘發(fā)炎癥因子分泌和釋放可能參與了GDM的發(fā)病過(guò)程,蛋白質(zhì)乙?;谡{(diào)控蛋白質(zhì)功能上具有簡(jiǎn)單的開關(guān)作用,屬于一種動(dòng)態(tài)可逆的翻譯后修飾。但現(xiàn)階段關(guān)于乙?;疶LR4在GDM體內(nèi)是否表達(dá)并發(fā)揮一定作用尚不明晰。故此,本研究深入探討了乙酰化TLR4在GDM孕婦外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及在LPSTLR4-NF-κB通路中的作用,現(xiàn)報(bào)告如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料 選取2017年1月至2017年10月在我院治療的GDM孕婦67例(GDM組),納入標(biāo)準(zhǔn):⑴診斷符合國(guó)際妊娠合并糖尿病研究組(IADPSG)制定的標(biāo)準(zhǔn);⑵孕周在24~28周;⑶年齡<35歲;⑷孕婦及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):⑴非單胎妊娠;⑵合并有感染、妊娠期高血壓、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、肝腎功能損害等疾病。同時(shí)選取健康孕婦67例作為對(duì)照組,GDM組和對(duì)照組孕婦年齡、孕周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

        表1 兩組孕婦一般資料比較

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用Western blot法檢測(cè)TLR4、乙?;疶LR4和NF-κB p65蛋白表達(dá):冰上裂解細(xì)胞,分別離心后取上清置于EP管中,提取總蛋白后,取20ug總蛋白行SDS-PAGE電泳,常規(guī)轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉2h室溫封閉,分別加入適量對(duì)應(yīng)抗體,孵育(4℃)一抗過(guò)夜,洗滌后二抗孵育,ECL發(fā)光試劑盒曝光顯影。

        微板法檢測(cè)血清脂多糖(LPS):陰性對(duì)照管加入100ul細(xì)菌內(nèi)毒素檢查水,待檢管加入100ul內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,供試品管加入100ul供試品,三管均加入100ul鱟試劑后混勻,37℃孵育10min,各加入100ul顯色基質(zhì)溶液,混勻后37℃孵育6min,各管均加入500ul偶氮試劑1溶液,混勻后各管均加入500ul偶氮試劑2溶液,混勻靜置后酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度[5]。

        ELISA法檢測(cè)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)和白細(xì)胞介素-10(IL-10),試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件,計(jì)量資料采用(±s)表示,兩組間比較使用t檢驗(yàn),相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 兩組TLR4及乙?;疶LR4表達(dá)比較 GDM組和對(duì)照組TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);GDM組檢測(cè)到乙?;疶LR4相對(duì)表達(dá),而對(duì)照組未檢測(cè)到乙?;疶LR4表達(dá)。見表2。

        表2 兩組TLR4及乙酰化TLR4表達(dá)比較

        2.2 兩組 LPS、TNF-α、IL-1及 IL-10比較 GDM組 LPS、TNF-α、IL-1 及 IL-10 明顯高于對(duì)照組(P<0.05),見表 3。

        表3 兩組LPS、TNF-α、IL-1及IL-10比較

        2.3 兩組 NF-κB p65表達(dá)比較 GDM 組 NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05),見表4。

        2.4 相關(guān)分析 將GDM組乙?;疶LR4相對(duì)表達(dá)與 LPS、TNF-α、IL-1、IL-10 及 NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析,結(jié)果顯示乙?;疶LR4 相對(duì)表達(dá)與 LPS、TNF-α、IL-1、IL-10 及 NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)呈正相關(guān) (r=0.321、0.304、0.335、0.341 和 0.482,P<0.05)。

        表4 兩組NF-κB p65表達(dá)比較

        3 討論

        GDM是于妊娠期診斷的糖耐量減低和糖尿病的總和,研究發(fā)現(xiàn)本病可伴發(fā)多項(xiàng)并發(fā)癥,經(jīng)資料[6,7]分析總結(jié)其對(duì)孕婦的影響主要包括;早期胚胎發(fā)育異常、感染、流產(chǎn),甚至死亡,羊水過(guò)多、妊娠期高血壓疾病、分娩后代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加等;其對(duì)胎兒及新生兒的影響主要包括:胎兒生長(zhǎng)受限 (fetal growth restriction,F(xiàn)GR)、巨大胎兒、新生兒低血糖、畸形及呼吸窘迫綜合征等病癥。

        研究[8]認(rèn)為GDM的主要病因是胰島素受損和胰島素抵抗,而孕婦體內(nèi)炎癥狀態(tài)與兩者的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。TLR4可誘發(fā)多種免疫炎癥反應(yīng)并已成為多種炎癥疾病的重要生理、病理基礎(chǔ)。資料[9]顯示乙?;堑鞍踪|(zhì)重要的翻譯后修飾過(guò)程,可調(diào)控不同的細(xì)胞質(zhì)過(guò)程,并與細(xì)胞核存在重要作用,單核細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA表達(dá)的增加也促進(jìn)了GDM的發(fā)生。Xu C[10]的研究發(fā)現(xiàn)TLR4蛋白是炎癥通路活化的必要條件,其在翻譯后可被乙?;M(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)。LPS-TLR4-NF-κB通路屬于重要的TLR4信號(hào)通路,已成為GDM發(fā)病機(jī)制的重要方向[11]。Zhang Y[12]通過(guò)對(duì)炎癥因子表達(dá)與 TLR4、NF-κB mRNA的相關(guān)性分析證實(shí)LPS-TLR4-NF-κB通路的激活與GDM關(guān)系密切。但現(xiàn)階段關(guān)于TLR4乙?;贕DM體內(nèi)是否表達(dá)及作用機(jī)制尚不明晰。故此,本研究深入探討了乙?;疶LR4在GDM孕婦外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及在LPS-TLR4-NF-κB通路中的作用。

        GDM組和對(duì)照組TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);GDM組TLR4乙?;鄬?duì)表達(dá)為(1.012±0.062),而對(duì)照組未檢測(cè)到乙?;疶LR4表達(dá),差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明GDM患者存在乙?;疶LR4的過(guò)度表達(dá),并提示TLR4乙酰化可作為GDM患者早期診斷和預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。

        GDM 組 LPS、TNF-α、IL-1 及 IL-10 分別為(0.95 ±0.11)IU/ml、 (56.01 ±3.18)pg/ml、 (76.82 ±3.05)pg/ml和(32.17±4.07)pg/ml,明顯高于對(duì)照組(P<0.05);GDM 組 NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)為(0.763±0.073),明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。 因妊娠期孕婦體內(nèi)環(huán)境可出現(xiàn)適應(yīng)性改變,患者腸道菌群可導(dǎo)致LPS異位進(jìn)入外周循環(huán),可誘導(dǎo)多種細(xì)胞的TLR4活化及獨(dú)立誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IR外,將炎癥通路激活[13]。故而,GDM 患者 LPS、TNF-α、IL-1及IL-10水平高于對(duì)照組。筆者推測(cè)LPS可能通過(guò)提高乙?;疶LR4進(jìn)而活化炎癥通路,加速炎癥因子的表達(dá)。此外,IL-10的升高幅度相對(duì)低于TNF-α和IL-1,說(shuō)明GDM孕婦體內(nèi)低度炎癥狀態(tài)可能通過(guò)增加乙?;疶LR4的敏感性從而加劇了抗炎-致炎的失衡[14]。

        GDM組TLR4乙酰化相對(duì)表達(dá)與LPS、TNF-α、IL-1、IL-10及 NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明了TLR4通過(guò)翻譯后的乙?;揎椬饔谜{(diào)控著孕婦體內(nèi)LPS-TLR4-NF-κB 通路的活化程度。 LPS、TNF-α、IL-1、IL-10 升高可導(dǎo)致胰島功能的損傷和IR的形成。IL-1、IL-10即是作為體內(nèi)重要的抗炎細(xì)胞因子并能抑制NF-κB,發(fā)揮抑制炎性細(xì)胞分泌炎性因子的作用[15]。此外,筆者認(rèn)為在研究妊娠期糖尿病的發(fā)病機(jī)制時(shí),還要考慮妊娠這一特殊生理?xiàng)l件對(duì)妊娠期糖尿病的影響,妊娠期間特殊的內(nèi)分泌和代謝變化是妊娠期糖尿病發(fā)生的重要因素。但本研究存在一定缺陷,本研究?jī)H在體外環(huán)境下進(jìn)行,然而人體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境是否對(duì)乙酰化TLR4修飾產(chǎn)生影響,仍需要大樣本研究證實(shí)。

        綜上所述,GDM孕婦外周血單核細(xì)胞存在乙?;疶LR4,其與炎癥因子水平有一定相關(guān)性,值得進(jìn)一步研究。

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