劉景祎，李富慧，張保朝

(南陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽 473000)

急性缺血性腦卒中的發(fā)生，能夠顯著增加患者的病死率。長期的流行病學(xué)研究顯示，急性缺血性腦卒中的發(fā)病率可達(dá)344～556/10萬人左右[1]，在合并有高血壓或者糖尿病等的人群中，急性缺血性腦卒中的發(fā)病率具有進(jìn)一步的上升趨勢。

不同的生物學(xué)因子的改變，能夠引起局部血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，增加粥樣斑塊的形成，導(dǎo)致血管平滑肌的痙攣等，促進(jìn)缺血性腦卒中的發(fā)生[2]。血清蛋白質(zhì)Z（PZ）是重要的凝血因子相關(guān)蛋白，其表達(dá)濃度的改變能夠通過抑制凝血因子的激活，抑制血小板性血栓的形成，穩(wěn)定局部血流動力學(xué)，降低缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3，4]。部分研究已經(jīng)探討了PZ蛋白在缺血性腦卒中中的異常表達(dá)情況，認(rèn)為高表達(dá)的PZ蛋白是減輕患者頸部動脈狹窄、降低粥樣斑塊形成的重要因素，但對于PZ蛋白的基因多態(tài)性的分析研究不足。本研究進(jìn)一步探討PZ蛋白的表達(dá)及其FG79A基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中的關(guān)系，從而為臨床上患者的病情評估提供參考。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2015年1月至2017年12月在我院治療的急性缺血性腦卒中患者157例 （觀察組），納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南》中的標(biāo)準(zhǔn)；⑵發(fā)病到入院時(shí)間＜24h；⑶患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并有惡性腫瘤、自身免疫性疾病、肝腎功能不全等疾??；⑵檢查前已接受凝血、抗纖溶等治療。同時(shí)選取健康志愿者160例作為對照組，觀察組和對照組受試者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），見表 1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 血清指標(biāo)檢查 采集空腹靜脈血約5ml，自然抗凝后以3000r/min離心10min，取上清液采用酶聯(lián)免疫吸附法測定PZ蛋白水平，檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司，具體檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；凝血功能指標(biāo)的檢測采用凝固法在全自動血凝儀中進(jìn)行FIB、PT和APTT等的檢測，PUN-2048系列半自動凝血分析儀購自日本Sysmex集團(tuán)。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢查 基因多態(tài)性檢測：取凍存的血清保存液體，按照10000r/min的離心速度進(jìn)行離心分離，每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，進(jìn)行裂解操作，4℃冰上采用無酶的RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次10000r/min離心5min，得到RNA?；旌弦涸诩尤肽孓D(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60min，室溫放置5min使其完全溶解，使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為模版，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達(dá)20ul，上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2min、93℃ 1min、55℃ 2min，共 40 個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后進(jìn)行基因多態(tài)性檢測：參考multiplexkit試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）使用說明，加入各位點(diǎn)對應(yīng)延伸引物進(jìn)行單堿基測序反應(yīng)。并在ABI1310（Life Technologies，美國）進(jìn)行電泳，結(jié)果用GENEMAPPER軟件（Life Technologies，美國）進(jìn)行分析。

引物序列：上游引物5-AACACCATAGACAGAGTCCGATATTCGC-3，下游引物5-ATGAACTCGGCATTAGAACATGGTTGGAA-3 1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析；采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)各組基因型分布情況。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對照組血清PA以及凝血參數(shù)水平比較 觀察組PZ明顯低于對照組（P＜0.05），而FIB明顯高于對照組（P＜0.05）；觀察組和對照組PT和APTT差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 觀察組和對照組血清PA以及凝血參數(shù)比較

2.2 觀察組不同病情患者血清PA以及凝血參數(shù)水平比較 根據(jù)腦卒中臨床神經(jīng)功能損傷程度（NDS）評分表對腦梗塞嚴(yán)重程度進(jìn)行分型，輕型（NDS評分≤15分）64例， 中型 （NDS評分16～30分）57例，重型（NDS評分≥31分）36例；重型患者PZ明顯低于輕型和中型患者（P＜0.05），而FIB明顯高于輕型和中型患者 （P＜0.05）；不同病情患者PT和APTT差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 觀察組不同病情患者血清PA以及凝血參數(shù)水平比較

2.3 相關(guān)性分析 將患者血清PZ水平與凝血參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示血清PZ與FIB呈負(fù)相關(guān)（r=-0.871，P＜0.05）。 見圖 1。

圖1 相關(guān)分析圖

2.4 觀察組和對照組PZ內(nèi)含子F中G79A多態(tài)性分布 觀察組和對照組FG79A基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律；觀察組和對照組FG79A基因型和等位基因分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 4。

2.5 觀察組不同F(xiàn)G79A基因型患者血清PZ水平比較 GG型患者血清PZ水平明顯高于AG型和AA型（P＜0.05）；AG型患者血清PZ水平明顯高于AA 型（P＜0.05）。 見表 5。

3 討論

臨床上急性腦卒中患者的病死率較高，通過包括改善微循環(huán)、抗凝或者神經(jīng)營養(yǎng)類藥物治療后，患者的神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)雖然有所改善，但治療后的病情緩解率仍然較低，治療后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能評分如美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale)等仍然無明顯的改善。越來越多的研究顯示，凝血因子相關(guān)功能的改變，可能是促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷，增加椎動脈動脈痙攣、狹窄和腦組織缺血程度的重要因素[5，6]。

PZ蛋白結(jié)構(gòu)上包含了多個(gè)巰基結(jié)合區(qū)域，其能夠通過對于末端的修飾作用，抑制血小板表面受體的激活，抑制血小板的活化程度，降低血小板性血栓的形成風(fēng)險(xiǎn)。PZ蛋白對于凝血因子Ⅴ的激活，能夠抑制內(nèi)源性凝血因子的激活，降低局部纖維蛋白溶解酶的上調(diào)程度，減輕局部血管內(nèi)皮下纖維組織的沉積，并穩(wěn)定早期發(fā)病過程中纖維蛋白溶解系統(tǒng)的激活過程[7]。近年來相關(guān)基礎(chǔ)方面的研究顯示，PZ蛋白能夠在影響到缺血再灌注損傷、微循環(huán)障礙、腦血管疾病的發(fā)生、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用，能夠抑制惡性腫瘤及感染性疾病的發(fā)生[8]，從而發(fā)揮保護(hù)性的作用[9]。而對于PZ蛋白與缺血性腦卒中的相關(guān)研究顯示，PZ蛋白能夠穩(wěn)定內(nèi)皮下膠原蛋白的暴露過程中的凝血因子的激活，平衡凝血-抗凝過程，降低血栓的形成風(fēng)險(xiǎn)，改善腦血管的臨床結(jié)局[10]。而本次研究在探討了PZ蛋白的表達(dá)差異的同時(shí)，揭示了PZ蛋白FG79A基因型的差異與缺血性腦卒中患者的關(guān)系。

本研究通過血清學(xué)指標(biāo)的分析研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中患者血清中存在相關(guān)指標(biāo)的顯著低表達(dá)，其中PZ蛋白的陽性表達(dá)率可顯著下降，同時(shí)患者病情越嚴(yán)重，PZ蛋白的表達(dá)下降越明顯，提示PZ蛋白的異常表達(dá)可能參與到了缺血性腦卒中的病情進(jìn)展過程中[11，12]：⑴PZ蛋白的低表達(dá)，失去了其對于發(fā)病早期體內(nèi)凝血因子的抑制作用，導(dǎo)致凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅲ等因子的表達(dá)濃度明顯上升；⑵PZ蛋白的低表達(dá)，導(dǎo)致患者體內(nèi)的纖維蛋白的溶解增多，體內(nèi)凝血因子從高凝期轉(zhuǎn)為消耗性低凝期的速度明顯增快。湯榮華等[13]研究者在探討了82例樣本量的缺血性腦卒中患者的血清學(xué)資料后發(fā)現(xiàn)，PZ蛋白的陽性表達(dá)率可平均下降25%以上，同時(shí)患者的DIC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高，體內(nèi)血栓的形成率越高，血清中PZ蛋白的表達(dá)濃度上升越為明顯。纖維蛋白原(plasma fibrinogen，F(xiàn)IB)濃度是評估患者體內(nèi)的凝血因子的重要指標(biāo)，過度激活的凝血過度增加了纖維蛋白的合成及釋放，提高血清中FIB的濃度，過度上升的FIB在短期內(nèi)對于凝血功能的維持具有一定的穩(wěn)定作用，持續(xù)性上升的FIB可以增加血栓的形成風(fēng)險(xiǎn)，增加腦梗塞的發(fā)生可能[14]。相關(guān)性分析也可以發(fā)現(xiàn)，PZ與FIB呈負(fù)相關(guān)，提示二者可能具有一定內(nèi)在關(guān)系，PZ蛋白能夠通過對于增加對于交聯(lián)蛋白酶原的分解作用，其與FIB的釋放呈正相關(guān)。FG79A基因型在病例組或者正常對照人群中并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示FG79A基因型的差別并不會影響缺血性腦卒中的發(fā)生，但可以發(fā)現(xiàn)FG79A基因型中G等位基因的差別，能夠影響到血清PZ蛋白水平，這主要考慮與維生素K酶、鈣離子結(jié)合的糖蛋白酶的激活作用有關(guān)，從而增加了PZ等抑制性蛋白的合成[15]。

表4 觀察組和對照組FG79A多態(tài)性分布

表5 觀察組不同F(xiàn)G79A基因型患者血清PZ水平比較

綜上所述，血清PZ在急性缺血性腦卒中明顯降低，與病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)G79A基因多態(tài)性與血清PZ水平有一定關(guān)系。