肖子衿 ,李永杰 ,王伶
(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科,江西 南昌 330006;2、江西師范大學(xué)附屬中學(xué),江西 南昌 330003;3、新余市渝水區(qū)人民醫(yī)院,江西 新余 338000)
免疫比濁法是將免疫反應(yīng)引入生化檢測領(lǐng)域而形成的生化-免疫聯(lián)合應(yīng)用技術(shù),它同時具備生化檢測的快速和免疫分析的高敏感、高特異性,是將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器與自動化檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)的方法,可對各種液體介質(zhì)中微量抗原、抗體和藥物以及小分子半抗原物質(zhì)進行定量測定[1]。生化分析儀中應(yīng)用免疫比濁法對尿微量白蛋白濃度進行測定時,過量m-ALB在反應(yīng)中出現(xiàn)后帶現(xiàn)象[2,3],導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差、臨床誤判,所以,通過在生化分析儀上設(shè)置正確的預(yù)警參數(shù),使其在檢測m-ALB時出現(xiàn)的后帶現(xiàn)象時給出報警[4,5]。本研究通過對一系列高低濃度的尿微量白蛋白(mALB)進行測定,研究分析不同濃度標(biāo)本時間-吸光度曲線和劑量-最終吸光度曲線的變化趨勢,探討奧林帕斯全自動生化儀尿m-ALB測定時后帶現(xiàn)象的預(yù)警參數(shù)設(shè)置方法。
1.1 材料 mALB高濃度樣品來自本院患者,離心尿液后置-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫琺ALB低濃度樣品來自試驗當(dāng)天本院健康體檢者。
1.2 儀器與試劑
1.2.1 儀器Beckman AU5800全自動生化分析儀
1.2.2 試劑mALB測定試劑盒(免疫比濁法)及校準品。當(dāng)天質(zhì)控在控,當(dāng)年室間質(zhì)評PT成績?yōu)?00。
1.3 方法
1.3.1 主要上機檢測參數(shù)參照m-ALB試劑說明書設(shè)置
1.3.2 mALB最大稀釋倍數(shù)和臨床可分析范圍的確定 分析測量范圍確認方法參考(CLSI)的EP6-A的文件[6],取一份高濃度標(biāo)本,樣本用生理鹽水進行系列稀釋, 稀釋倍數(shù)分別為 3、5、10、20、50、100倍,每個樣本濃度重復(fù)測定3次,取樣本稀釋后得出的平均結(jié)果為檢測值,檢測值乘以稀釋倍數(shù)與原倍結(jié)果進行比較,計算各稀釋倍數(shù)的實測偏倚,實測偏倚應(yīng)在 0.9~1.1 范圍內(nèi)。
1.3.3 系列稀釋濃度梯度的mALB樣本配制與測定 將收集入院患者高濃度mALB樣本5份,使用生理鹽水進行稀釋重復(fù)測定3次取平均結(jié)果(5份樣 本 濃 度 分 別 如 下 :736.5μg/L、2106.9μg/L、2975.7μg/L、4882.9μg/L、24978.5μg/L);將上述高濃度 標(biāo) 本 配 制 成 41.67、208.34、340.7、416.67、625.01、1008.37、1176.43、1344.49、1680.62、1782.7、1910.03、2250.37、2790.33、3631.5、6886.91、9838.44μg/L 共 16 個濃度梯度。 將系列稀釋濃度標(biāo)本進行編號(標(biāo)本1、標(biāo)本2……標(biāo)本16)并上機檢測,每個標(biāo)本測定3次取平均值,記錄系列濃度標(biāo)本各監(jiān)測點吸光度、試劑空白對照與最終吸光度。根據(jù)最終吸光度峰值(標(biāo)本13)的標(biāo)本濃度,再對該峰值附近濃度進行配置,配置濃度為1737.55、1848.68、1941.97、2016.74μg/L, 標(biāo)本編號為:標(biāo)本 17、標(biāo)本 18、標(biāo)本 19、標(biāo)本 20,記錄該 4個濃度標(biāo)本各監(jiān)測點吸光度、試劑空白對照與最終吸光度。
1.3.4 mALB劑量-最終吸光度曲線分析 將上述記錄的20個標(biāo)本的最終吸光度與標(biāo)本濃度繪制成劑量-最終吸光度曲線,確定劑量-反應(yīng)曲線的平衡點(吸光度峰值對應(yīng)的濃度,即拐點處)。
1.3.5 系列濃度標(biāo)本時間-吸光度曲線分析 奧林帕斯全自動生化儀采用0~27讀點共28個監(jiān)測點進行反應(yīng)監(jiān)測,每個間隔點時間為19s,在0讀點前加入試劑1(R1),在0~1讀點間加入樣本,在10~11讀點間加入試劑2(R2)。將上述記錄的20個標(biāo)本各監(jiān)測點吸光度與試劑空白對照相減,所得差值乘以10000后與樣本各監(jiān)測點繪制時間吸光度曲線,觀察系列濃度標(biāo)本反應(yīng)曲線的變化趨勢。
2.1 mALB最大稀釋倍數(shù)的確認 使用生理鹽水進行系列稀釋 3、5、10、20、50、100 倍的實測偏倚分別為 9.5%、1.68%、3.47%、6.78%、25.07%,100 倍稀釋不在10%范圍內(nèi),所以mALB最大稀釋倍數(shù)為50倍,由于檢測的線性范圍是0-300μg/L,因而臨床可報告范圍為 0-15000μg/L。
2.2 mALB劑量-最終吸光度曲線分析mALB劑量-最終吸光度曲線如圖1所示,標(biāo)本最終吸光度隨著濃度的升高,其吸光度也在升高,一直到標(biāo)本18(1848.68μg/L)達到峰值,即 mALB 劑量-最終吸光度曲線平衡點濃度為1848.68μg/L,在平衡點濃度之前,吸光度隨著濃度的增加而增加,在平衡點之后,吸光度則開始降低。
圖1 mALB劑量-最終吸光度曲線
2.3 系列濃度標(biāo)本時間-吸光度曲線分析 系列濃度標(biāo)本時間-吸光度曲線如圖2所示,一系列濃度標(biāo)本時間-吸光度曲線都隨著時間的增加而增加。于監(jiān)測點10~11之間加入R2之后,各標(biāo)本在監(jiān)測點11~27之間的時間-吸光度曲線均開始上升,后續(xù)反應(yīng)過程曲線較平滑。隨著反應(yīng)濃度的增加,吸光度曲線并不繼續(xù)升高,標(biāo)本濃度越高,前期曲線增長越快,后期則逐漸趨近平滑,抗原過量的后帶效應(yīng)也越來越明顯。
圖2 mALB時間-吸光度曲線
2.4 抗體過量的參數(shù)設(shè)置通過對mALB劑量-最終吸光度曲線與系列濃度標(biāo)本時間-吸光度曲線研究分析,選擇15讀點到11讀點差值與27讀點到11讀點差值的比值>0.6000,并且27讀點到11讀點差值>0.0716作為抗原過量的判斷標(biāo)準。各濃度讀點差值的比值見表1。當(dāng)mALB濃度小于或等于標(biāo)本 3(340.7μg/L),各濃度讀點差值的比值=<0.6000 或讀點 27 到讀點 11 差值=<0.0716 時,儀器不發(fā)生報警;當(dāng)mALB濃度大于標(biāo)本3(340.7μg/L),各濃度讀點差值的比值>0.6000且讀點27到讀點11差值>0.0716時,儀器提示后帶效應(yīng)并產(chǎn)生報警。
2.5 后帶現(xiàn)象預(yù)警參數(shù)的設(shè)置 根據(jù)一系列mALB濃度的劑量-最終吸光度曲線和時間吸光度曲線,對AU5800進行后帶預(yù)警參數(shù)的設(shè)置,進入首頁-菜單列表-參數(shù)-其他,選擇數(shù)據(jù)檢查參數(shù),出現(xiàn)邏輯檢查1,2,3。進入編輯狀態(tài),選擇邏輯檢查1,測試名稱選擇mALB。邏輯檢查1中有檢查點1,2,3,用于讀點的數(shù)值計算,分別輸入 11,15,27。邏輯檢查1中的判定值1,2,3則需要符合0.0=<判定值 1=<2.0,判定值 1=<判定值 2=<9.0,0.0=<判定值 3=<3.0,分別輸入 0.6000,9.000,0.716。 極限點1,2是設(shè)置檢查點之外的判定點,輸入11,27。檢查類型選擇類型1,其意味著應(yīng)用判定公式1和2,即公式1和2都滿足。公式1:判定值1=<OD(檢查點2-檢查點1)/OD(檢查點3-檢查點1)=<判定值 2,公式 2:判定值 3=<(極限點 2-極限點 1)。見圖3完成檢查參數(shù)的設(shè)置,參數(shù)設(shè)置完成后,采用不同mALB濃度樣品進行結(jié)果驗證,mALB濃度超過340μg/L的樣品基本都能成功識別,樣品數(shù)值變紅,并產(chǎn)生報警提醒(Z)見圖4,有效的避免檢測結(jié)果的偏差。
表1 不同濃度mALB樣品抗原過量檢查參數(shù)判定值
圖3 Olympus5800系列尿微量白蛋白檢查參數(shù)的設(shè)置
圖4 高濃度樣本的報警驗證
免疫比濁法的基本原理是當(dāng)抗原與抗體在稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)比例適當(dāng)時,形成的免疫復(fù)合物在沉淀促進劑的作用下,于液相中形成微粒,并產(chǎn)生濁度,當(dāng)抗體過量且固定時,溶液中待測抗原的濃度在一定范圍內(nèi)與免疫復(fù)合物的生成量成正比[2]??乖?、抗體劑量反應(yīng)曲線是由Heidel berger于1929年首次發(fā)現(xiàn)[7,8],在抗體過量階段,沉淀物的量隨著抗原濃度成比例增加,當(dāng)抗原濃度的增加不再增強信號時,就達到了平衡點,進一步增加抗原的量會導(dǎo)致沉淀總量的減少。因此當(dāng)其出現(xiàn)在生化分析儀檢測上時,將使檢驗結(jié)果產(chǎn)生較大誤差,影響臨床診斷與治療[8]。在臨床實際工作中,用手工或儀器對樣品進行前稀釋,也可解決鉤狀效應(yīng)的問題,但這方法有時會導(dǎo)致抗原含量遠遠低于抗體含量,手工或儀器前稀釋也會增加工作量和試劑成本[9,10]。
根據(jù)圖1mALB劑量-最終吸光度曲線和圖2mALB時間-吸光度曲線變化關(guān)系可知,mALB檢測方法對高劑量濃度標(biāo)本存在著明顯的后帶效應(yīng)[11]。圖1 顯示,標(biāo)本 18(1848.68μg/L)的濃度值為曲線的峰值(最終吸光度隨著濃度增長轉(zhuǎn)而下降),隨即認為標(biāo)本18濃度為鉤狀效應(yīng)的拐點,但從圖2曲線變化可知,在曲線的峰值標(biāo)本18(1848.68μg/L)的濃度值之前,即標(biāo)本 3(340.7μg/L)開始時間-吸光度曲線一直處于上升的趨勢,曲線的間隔已經(jīng)越來越小。因此,通過在奧林帕斯生化儀檢測尿微量白蛋白中設(shè)置后帶現(xiàn)象預(yù)警參數(shù)來有效識別反應(yīng)體系中的后帶現(xiàn)象是非常重要的[12]。
通過圖2可知,當(dāng)反應(yīng)體系中mALB抗原含量固定,加入超敏化的mALB抗體過剩時,前期吸光度與試劑空白的差值上升速率較快,待mALB抗原與mALB抗體結(jié)合較多后,上升速率增加不明顯。當(dāng)我們通過分析圖1可知,最終吸光度和吸光度與試劑空白的差值是不一樣的,通過特定公式進行轉(zhuǎn)換,標(biāo)本 18(1848.68μg/L)的濃度值達到反應(yīng)曲線的峰值,即標(biāo)本濃度在1848.68μg/L之前時一直處于正反應(yīng)狀態(tài),在1848.68μg/L之后則會出現(xiàn)下降的趨勢。由此可知,在設(shè)置后帶現(xiàn)象預(yù)警參數(shù)時,正確認識與理解時間、濃度、吸光度之間的變化特點是成功設(shè)置的前提。
免疫比濁法中鉤狀效應(yīng)預(yù)警參數(shù)的設(shè)定都是從反應(yīng)曲線入手。劉忠民[13,14]等人以IgG為例,通過分別分析抗體過剩與抗原過剩反應(yīng)曲線,選擇20讀點的反應(yīng)完成率來設(shè)置預(yù)警參數(shù)。在本研究中,不論抗體過剩還是抗原過剩,其時間-吸光度反應(yīng)曲線都是一直上升的,當(dāng)樣本中mALB抗原濃度不斷增加時,其28個讀點的吸光度都會隨之不斷變化,各濃度標(biāo)本讀點之間差值的比值卻在不斷上升。騰曉梅[15]則直接對超過測量范圍極限值上限的標(biāo)本進行稀釋測定,但本文中圖2顯示,標(biāo)本 20(9838.44μg/L)的實際濃度遠遠超過測量范圍的上限,但當(dāng)標(biāo)本20上機測定時,因最終吸光度較低,儀器顯示標(biāo)本20的濃度為664μg/L,表明高濃度標(biāo)本由于后帶效應(yīng)導(dǎo)致最終吸光度反而較低,使得測定值較小。
本試驗mALB的檢測方法應(yīng)用免疫比濁法,使mALB抗體與標(biāo)本中mALB抗原結(jié)合。通過觀察mALB時間-吸光度曲線和mALB劑量-最終吸光度曲線的變化,最終選擇15讀點到11讀點差值與27讀點到11讀點差值的比值>0.6000,并且27讀點到11讀點差值>0.0716作為抗原過量的判斷標(biāo)準來識別反應(yīng)體系中存在的后帶效應(yīng)。如反應(yīng)體系中存在后帶效應(yīng),儀器則出現(xiàn)報警提示,工作人員對標(biāo)本進行手工合理稀釋重測。
綜上所述,免疫比濁法用于mALB檢測時一直受到“后帶效應(yīng)”的干擾,導(dǎo)致臨床誤判,因此設(shè)置后帶效應(yīng)報警提示具有非常重要的臨床價值。本研究針對奧林帕斯檢測mALB產(chǎn)生后帶現(xiàn)象預(yù)警基本達到要求,隨著技術(shù)的發(fā)展,鉤狀效應(yīng)預(yù)警參數(shù)的應(yīng)用將會越來越廣,研究同一類型的生化分析儀對不同檢驗項目設(shè)置預(yù)警參數(shù)則需要我們不停的探索。