肖子衿 ，李永杰 ，王伶

(1、南昌大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；2、江西師范大學附屬中學，江西 南昌 330003；3、新余市渝水區(qū)人民醫(yī)院，江西 新余 338000)

免疫比濁法是將免疫反應引入生化檢測領域而形成的生化－免疫聯合應用技術，它同時具備生化檢測的快速和免疫分析的高敏感、高特異性，是將現代光學測量儀器與自動化檢測系統(tǒng)相結合應用于沉淀反應的方法，可對各種液體介質中微量抗原、抗體和藥物以及小分子半抗原物質進行定量測定[1]。生化分析儀中應用免疫比濁法對尿微量白蛋白濃度進行測定時，過量m－ALB在反應中出現后帶現象[2，3]，導致檢測結果出現偏差、臨床誤判，所以，通過在生化分析儀上設置正確的預警參數，使其在檢測m－ALB時出現的后帶現象時給出報警[4，5]。本研究通過對一系列高低濃度的尿微量白蛋白（mALB）進行測定，研究分析不同濃度標本時間－吸光度曲線和劑量－最終吸光度曲線的變化趨勢，探討奧林帕斯全自動生化儀尿m－ALB測定時后帶現象的預警參數設置方法。

1 材料和方法

1．1 材料 mALB高濃度樣品來自本院患者，離心尿液后置－20°C冰箱內保存?zhèn)溆茫琺ALB低濃度樣品來自試驗當天本院健康體檢者。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 儀器Beckman AU5800全自動生化分析儀

1．2．2 試劑mALB測定試劑盒（免疫比濁法）及校準品。當天質控在控，當年室間質評PT成績?yōu)?00。

1．3 方法

1．3．1 主要上機檢測參數參照m－ALB試劑說明書設置

1．3．2 mALB最大稀釋倍數和臨床可分析范圍的確定 分析測量范圍確認方法參考（CLSI）的EP6－A的文件[6]，取一份高濃度標本，樣本用生理鹽水進行系列稀釋， 稀釋倍數分別為 3、5、10、20、50、100倍，每個樣本濃度重復測定3次，取樣本稀釋后得出的平均結果為檢測值，檢測值乘以稀釋倍數與原倍結果進行比較，計算各稀釋倍數的實測偏倚，實測偏倚應在 0．9～1．1 范圍內。

1．3．3 系列稀釋濃度梯度的mALB樣本配制與測定 將收集入院患者高濃度mALB樣本5份，使用生理鹽水進行稀釋重復測定3次取平均結果(5份樣 本 濃 度 分 別 如 下 ：736．5μg/L、2106．9μg/L、2975．7μg/L、4882．9μg/L、24978．5μg/L)；將上述高濃度 標 本 配 制 成 41．67、208．34、340．7、416．67、625．01、1008．37、1176．43、1344．49、1680．62、1782．7、1910．03、2250．37、2790．33、3631．5、6886．91、9838．44μg/L 共 16 個濃度梯度。 將系列稀釋濃度標本進行編號（標本1、標本2……標本16）并上機檢測，每個標本測定3次取平均值，記錄系列濃度標本各監(jiān)測點吸光度、試劑空白對照與最終吸光度。根據最終吸光度峰值（標本13）的標本濃度，再對該峰值附近濃度進行配置，配置濃度為1737．55、1848．68、1941．97、2016．74μg/L， 標本編號為：標本 17、標本 18、標本 19、標本 20，記錄該 4個濃度標本各監(jiān)測點吸光度、試劑空白對照與最終吸光度。

1．3．4 mALB劑量－最終吸光度曲線分析 將上述記錄的20個標本的最終吸光度與標本濃度繪制成劑量－最終吸光度曲線，確定劑量－反應曲線的平衡點（吸光度峰值對應的濃度，即拐點處）。

1．3．5 系列濃度標本時間－吸光度曲線分析 奧林帕斯全自動生化儀采用0～27讀點共28個監(jiān)測點進行反應監(jiān)測，每個間隔點時間為19s，在0讀點前加入試劑1（R1），在0～1讀點間加入樣本，在10～11讀點間加入試劑2（R2）。將上述記錄的20個標本各監(jiān)測點吸光度與試劑空白對照相減，所得差值乘以10000后與樣本各監(jiān)測點繪制時間吸光度曲線，觀察系列濃度標本反應曲線的變化趨勢。

2 結果

2．1 mALB最大稀釋倍數的確認 使用生理鹽水進行系列稀釋 3、5、10、20、50、100 倍的實測偏倚分別為 9．5%、1．68%、3．47%、6．78%、25．07%，100 倍稀釋不在10%范圍內，所以mALB最大稀釋倍數為50倍，由于檢測的線性范圍是0－300μg/L，因而臨床可報告范圍為 0－15000μg/L。

2．2 mALB劑量－最終吸光度曲線分析mALB劑量－最終吸光度曲線如圖1所示，標本最終吸光度隨著濃度的升高，其吸光度也在升高，一直到標本18（1848．68μg/L）達到峰值，即 mALB 劑量－最終吸光度曲線平衡點濃度為1848．68μg/L，在平衡點濃度之前，吸光度隨著濃度的增加而增加，在平衡點之后，吸光度則開始降低。

圖1 mALB劑量-最終吸光度曲線

2．3 系列濃度標本時間－吸光度曲線分析 系列濃度標本時間－吸光度曲線如圖2所示，一系列濃度標本時間－吸光度曲線都隨著時間的增加而增加。于監(jiān)測點10～11之間加入R2之后，各標本在監(jiān)測點11～27之間的時間－吸光度曲線均開始上升，后續(xù)反應過程曲線較平滑。隨著反應濃度的增加，吸光度曲線并不繼續(xù)升高，標本濃度越高，前期曲線增長越快，后期則逐漸趨近平滑，抗原過量的后帶效應也越來越明顯。

圖2 mALB時間-吸光度曲線

2．4 抗體過量的參數設置通過對mALB劑量－最終吸光度曲線與系列濃度標本時間－吸光度曲線研究分析，選擇15讀點到11讀點差值與27讀點到11讀點差值的比值＞0．6000，并且27讀點到11讀點差值＞0．0716作為抗原過量的判斷標準。各濃度讀點差值的比值見表1。當mALB濃度小于或等于標本 3（340．7μg/L），各濃度讀點差值的比值=＜0．6000 或讀點 27 到讀點 11 差值=＜0．0716 時，儀器不發(fā)生報警；當mALB濃度大于標本3（340．7μg/L），各濃度讀點差值的比值＞0．6000且讀點27到讀點11差值＞0．0716時，儀器提示后帶效應并產生報警。

2．5 后帶現象預警參數的設置 根據一系列mALB濃度的劑量－最終吸光度曲線和時間吸光度曲線，對AU5800進行后帶預警參數的設置，進入首頁－菜單列表－參數－其他，選擇數據檢查參數，出現邏輯檢查1，2，3。進入編輯狀態(tài)，選擇邏輯檢查1，測試名稱選擇mALB。邏輯檢查1中有檢查點1，2，3，用于讀點的數值計算，分別輸入 11，15，27。邏輯檢查1中的判定值1，2，3則需要符合0．0=＜判定值 1=＜2．0，判定值 1=＜判定值 2=＜9．0，0．0=＜判定值 3=＜3．0，分別輸入 0．6000，9．000，0．716。 極限點1，2是設置檢查點之外的判定點，輸入11，27。檢查類型選擇類型1，其意味著應用判定公式1和2，即公式1和2都滿足。公式1：判定值1=＜OD(檢查點2－檢查點1)/OD(檢查點3－檢查點1)=＜判定值 2，公式 2：判定值 3=＜(極限點 2－極限點 1)。見圖3完成檢查參數的設置，參數設置完成后，采用不同mALB濃度樣品進行結果驗證，mALB濃度超過340μg/L的樣品基本都能成功識別，樣品數值變紅，并產生報警提醒（Z）見圖4，有效的避免檢測結果的偏差。

表1 不同濃度mALB樣品抗原過量檢查參數判定值

圖3 Olympus5800系列尿微量白蛋白檢查參數的設置

圖4 高濃度樣本的報警驗證

3 討論

免疫比濁法的基本原理是當抗原與抗體在稀釋系統(tǒng)中反應比例適當時，形成的免疫復合物在沉淀促進劑的作用下，于液相中形成微粒，并產生濁度，當抗體過量且固定時，溶液中待測抗原的濃度在一定范圍內與免疫復合物的生成量成正比[2]?？乖?、抗體劑量反應曲線是由Heidel berger于1929年首次發(fā)現[7，8]，在抗體過量階段，沉淀物的量隨著抗原濃度成比例增加，當抗原濃度的增加不再增強信號時，就達到了平衡點，進一步增加抗原的量會導致沉淀總量的減少。因此當其出現在生化分析儀檢測上時，將使檢驗結果產生較大誤差，影響臨床診斷與治療[8]。在臨床實際工作中，用手工或儀器對樣品進行前稀釋，也可解決鉤狀效應的問題，但這方法有時會導致抗原含量遠遠低于抗體含量，手工或儀器前稀釋也會增加工作量和試劑成本[9，10]。

根據圖1mALB劑量－最終吸光度曲線和圖2mALB時間－吸光度曲線變化關系可知，mALB檢測方法對高劑量濃度標本存在著明顯的后帶效應[11]。圖1 顯示，標本 18（1848．68μg/L）的濃度值為曲線的峰值（最終吸光度隨著濃度增長轉而下降），隨即認為標本18濃度為鉤狀效應的拐點，但從圖2曲線變化可知，在曲線的峰值標本18（1848．68μg/L）的濃度值之前，即標本 3（340．7μg/L）開始時間－吸光度曲線一直處于上升的趨勢，曲線的間隔已經越來越小。因此，通過在奧林帕斯生化儀檢測尿微量白蛋白中設置后帶現象預警參數來有效識別反應體系中的后帶現象是非常重要的[12]。

通過圖2可知，當反應體系中mALB抗原含量固定，加入超敏化的mALB抗體過剩時，前期吸光度與試劑空白的差值上升速率較快，待mALB抗原與mALB抗體結合較多后，上升速率增加不明顯。當我們通過分析圖1可知，最終吸光度和吸光度與試劑空白的差值是不一樣的，通過特定公式進行轉換，標本 18（1848．68μg/L）的濃度值達到反應曲線的峰值，即標本濃度在1848．68μg/L之前時一直處于正反應狀態(tài)，在1848．68μg/L之后則會出現下降的趨勢。由此可知，在設置后帶現象預警參數時，正確認識與理解時間、濃度、吸光度之間的變化特點是成功設置的前提。

免疫比濁法中鉤狀效應預警參數的設定都是從反應曲線入手。劉忠民[13，14]等人以IgG為例，通過分別分析抗體過剩與抗原過剩反應曲線，選擇20讀點的反應完成率來設置預警參數。在本研究中，不論抗體過剩還是抗原過剩，其時間－吸光度反應曲線都是一直上升的，當樣本中mALB抗原濃度不斷增加時，其28個讀點的吸光度都會隨之不斷變化，各濃度標本讀點之間差值的比值卻在不斷上升。騰曉梅[15]則直接對超過測量范圍極限值上限的標本進行稀釋測定，但本文中圖2顯示，標本 20（9838．44μg/L）的實際濃度遠遠超過測量范圍的上限，但當標本20上機測定時，因最終吸光度較低，儀器顯示標本20的濃度為664μg/L，表明高濃度標本由于后帶效應導致最終吸光度反而較低，使得測定值較小。

本試驗mALB的檢測方法應用免疫比濁法，使mALB抗體與標本中mALB抗原結合。通過觀察mALB時間－吸光度曲線和mALB劑量－最終吸光度曲線的變化，最終選擇15讀點到11讀點差值與27讀點到11讀點差值的比值＞0．6000，并且27讀點到11讀點差值＞0．0716作為抗原過量的判斷標準來識別反應體系中存在的后帶效應。如反應體系中存在后帶效應，儀器則出現報警提示，工作人員對標本進行手工合理稀釋重測。

4 結論與展望

綜上所述，免疫比濁法用于mALB檢測時一直受到“后帶效應”的干擾，導致臨床誤判，因此設置后帶效應報警提示具有非常重要的臨床價值。本研究針對奧林帕斯檢測mALB產生后帶現象預警基本達到要求，隨著技術的發(fā)展，鉤狀效應預警參數的應用將會越來越廣，研究同一類型的生化分析儀對不同檢驗項目設置預警參數則需要我們不停的探索。