李偉峰 ，陳立新 ，陳嘵俊 ，龔水帝 ，龐鳳祥 ，何曉銘 ，沈瑩姍 ，楊帆 ，楊鵬 ，何偉，魏秋實，陳鎮(zhèn)秋

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 三骨科，廣東 廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 三骨科保髖區(qū)，廣東 廣州 510405）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH）是由多種病因造成的股骨頭血液供應(yīng)不足或中斷，引起骨細胞漸進性凋亡，繼而導(dǎo)致股骨頭關(guān)節(jié)面塌陷的骨科疑難疾病，好發(fā)于20～40歲青壯年[1-2]。有研究表明骨重塑失衡和骨細胞凋亡是其病理改變過程中的重要環(huán)節(jié)[3-4]。Dickkopf-1（DKK-1）是Wnt信號通路拮抗劑，可抑制成骨細胞分化，促進成骨細胞凋亡，同時可刺激破骨細胞生成，是骨量的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5-6]。因此，在ONFH病情進展中，骨重塑失衡與骨細胞凋亡增加，可能伴隨著血清DKK-1蛋白濃度升高。本研究旨在探討血清DKK-1蛋白與ONFH病情進展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2016年11月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的ONFH患者67例作為實驗組。其中男性46例，女性21例；年齡19～65歲，平均（43.75±11.35）歲。納入標準：①符合2016年中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會關(guān)節(jié)外科學(xué)組制定的《股骨頭壞死臨床診療規(guī)范》的診斷標準[7]；②符合國際骨循環(huán)學(xué)會（association research circulation osseous, ARCO）的Ⅱ～Ⅳ期患者；③采血前未予任何干預(yù)措施?；颊甙床∫蚍诸悾簞?chuàng)傷性10例、酒精性24例、激素性23例、特發(fā)性10例；按ARCO分期分類：Ⅱ期13例、Ⅲ期27例、Ⅳ期27例。選取同期在本院體檢中心體檢正常且排除酗酒、近半年使用過影響骨代謝藥物或激素的健康群眾67例作為對照組。其中男性40例，女性27例；年齡19～65歲，平均（42.64±10.46）歲。兩組患者性別比例、平均年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2/t=1.169和0.589，P=0.368和0.557）?；颊呒韧鶡o冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、高血壓及乙肝等慢性病史。本研究符合赫爾辛基宣言，患者在納入研究前均簽署知情同意書并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（編號：20140307）。本研究在中國臨床試驗注冊中心注冊（注冊號：ChiCTR-RPC-15006290）。所有原始數(shù)據(jù)來自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)V1.0（登記號：2017SR274625）。

1.2 方法

1.2.1 血液標本采集 用真空采血管分別抽取兩組研究對象的空腹靜脈血約2 ml，置于4℃冰箱自然凝固后3 000 r/min離心5 min，提取血清，分裝后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DKK1蛋白的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定研究對象的血清DKK-1蛋白濃度，試劑盒購自美國的R＆D公司。檢測嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3 觀察指標

①兩組患者血清DKK-1蛋白濃度差異；②不同病因、ARCO分期之間的血清DKK-1蛋白濃度差異；③實驗組血清DKK-1蛋白濃度與ARCO分期的相關(guān)性分析；④血清DKK-1蛋白診斷股骨頭壞死塌陷的特異性及敏感性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析，計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗。相關(guān)分析采用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組組內(nèi)及與對照組組間血清DKK-1蛋白濃度比較

實驗組和對照組血清DKK-1蛋白濃度分別為（68.03±32.53）和（54.78±30.46）pg/ml，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.433，P=0.016），實驗組血清DKK-1蛋白濃度高于對照組。實驗組塌陷前與塌陷后的ONFH患者血清DKK-1蛋白濃度分別為（45.68±17.50）和（73.41±33.11）pg/ml，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-4.186，P=0.000）。實驗組創(chuàng)傷性、酒精性、激素性和特發(fā)性O(shè)NFH患者血清DKK-1蛋白濃度分別為（58.18±39.67）、（72.53±29.37）、（64.60±26.20）和（74.96±45.34）pg/ml，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.685，P=0.565）。實驗組ARCO Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期ONFH患者血清DKK-1蛋白濃度分別為（45.68±17.50）、（71.56±32.16）和（75.26±34.54）pg/ml，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.280，P=0.018），其中Ⅱ期與Ⅲ期患者血清DKK-1蛋白濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.523，P=0.016），Ⅱ期與Ⅳ期患者血清DKK-1蛋白濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.823，P=0.006），Ⅲ期與Ⅳ期患者血清DKK-1蛋白濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.000，P=0.662）。

2.2 ONFH患者血清DKK-1蛋白濃度與ARCO分期的相關(guān)性

血清DKK-1蛋白濃度與ARCO分期呈正相關(guān)（r=0.281，P=0.021）。見圖 1。

2.3 血清DKK-1蛋白診斷ONFH塌陷的敏感性及特異性

采用ROC曲線分析ONFH患者塌陷前及塌陷后血清DKK-1蛋白濃度，結(jié)果顯示:曲線下面積為0.754，敏感性為 57.40%（31/54）（95%CI：0.633，0.851）；特異性為 100.00%（0/13），cut-off值為＞71.71 pg/ml。見圖2。

圖1 血清DKK-1蛋白濃度與ONFH ARCO分期的相關(guān)性

圖2 血清DKK-1蛋白診斷ONFH塌陷的ROC曲線

3 討論

ONFH是導(dǎo)致青壯年髖關(guān)節(jié)功能障礙的常見疾病之一[8]。在未進行有效治療的情況下，80%的ONFH患者在1～3年內(nèi)會發(fā)展為股骨頭塌陷，大多數(shù)患者晚期會發(fā)展為嚴重的髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，不可避免的要行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)[9]。在中國，初次行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的費用是8 000～10 000美元，對患者造成巨大的經(jīng)濟負擔[10]。因此，早期發(fā)現(xiàn)及診斷ONFH，保留患者自身髖關(guān)節(jié)，對患者及社會都大有益處。而預(yù)防和糾正塌陷直接關(guān)系到保髖治療的效果[11]。

近年發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路與骨重塑密切相關(guān)，其中研究最多的是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路[12]。Wnt蛋白與卷曲蛋白在細胞外與受體LRP5/6結(jié)合形成復(fù)合物，啟動和激活Wnt/β-catenin信號通路。此通路一方面可促進成骨細胞增殖和分化，主導(dǎo)骨骼的發(fā)育和修復(fù)，另一方面可抑制破骨細胞分化，減少骨吸收[12-13]。

在骨骼系統(tǒng)中，DKK-1由成熟的成骨細胞和骨細胞分泌產(chǎn)生，是骨代謝和關(guān)節(jié)重塑的調(diào)節(jié)因子[14]。DKK-1可通過與受體LRP5/6結(jié)合而阻斷Wnt/β-catenin信號通路，減少成骨細胞增殖并增加其凋亡，同時可誘導(dǎo)破骨細胞分化和成熟、促進骨吸收，進而破壞骨穩(wěn)態(tài)，引起一系列骨病[5]。MANARA等[15]研究發(fā)現(xiàn)DKK-1表達增加，可促進成骨細胞凋亡，減少骨形成，影響骨重塑。DKK-1蛋白是成骨細胞的有效負調(diào)節(jié)因子[16]。

目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ONFH與骨細胞、成骨細胞凋亡和骨重塑失衡密切相關(guān)[3，17]。因此理論上血清DKK-1蛋白濃度會隨著ONFH患者病情發(fā)展而升高。本實驗結(jié)果表明，實驗組血清DKK-1蛋白濃度與對照組比較，在ONFH患者中升高，塌陷后較塌陷前升高，且與ARCO分期呈正相關(guān)，由ROC曲線可知，血清DKK-1蛋白在診斷股骨頭壞死塌陷時具有一定的敏感性和特異性。從ROC曲線計算的cutoff值有助于確定塌陷的臨界值，此臨界值可能為塌陷的征兆。因此，檢測血清DKK-1蛋白濃度有助于監(jiān)測ONFH患者病情進展，cut-off值可作為臨床預(yù)測股骨頭塌陷的參考指標。

本實驗結(jié)果也表明，不同病因的患者血清DKK-1蛋白濃度比較無差異，這可能是由于各種病因的ONFH均可造成骨重塑失衡、骨細胞凋亡。有學(xué)者通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)激素性壞死的小鼠股骨頭內(nèi)，成骨細胞數(shù)量和骨量明顯低于對照組，且伴有DKK-1表達增加[16-17]。魏秋實等[18]研究發(fā)現(xiàn)，激素性與酒精性O(shè)NFH標本內(nèi)空骨陷窩率明顯增高，存在骨細胞凋亡。MUTIJIMA等[19]研究發(fā)現(xiàn)不同病因的ONFH標本內(nèi)成骨細胞和骨細胞凋亡顯著高于非ONFH。上述學(xué)者的研究表明不同病因的ONFH均存在骨細胞凋亡，所以理論上不同病因的ONFH患者血清DKK-1蛋白濃度均會升高。

綜上所述，血清DKK-1蛋白濃度與股骨頭壞死患者病情發(fā)展密切相關(guān)，在臨床上，可作為ONFH早期診斷及治療的參考指標之一，也可為今后ONFH的病情監(jiān)測及預(yù)防塌陷提供一定的理論依據(jù)。但目前對于DKK-1參與ONFH的具體過程仍未完全了解，還需進一步的實驗研究，其臨床價值同樣也需要更有力的臨床研究來證實。