凌洪，張晶晶，卿國忠，涂書玎，鐘警

（南華大學附屬第一醫(yī)院 急診外科，湖南 衡陽 421001）

急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）最常見的并發(fā)癥[1]，且肺氣血屏障通透性增加在SAP/ALI病理機制中扮演了關鍵角色[2]。有研究表明，叉頭框蛋白M1（forkhead box M1, FOXM1）在肺損傷時可被激活，促進肺微血管內皮細胞增殖，降低屏障通透性[3]。然而也有研究提示，F(xiàn)OXM1的異常上調，可使DNA復制失控，出現(xiàn)惡變[4]。那么，SAP/ALI發(fā)生后，F(xiàn)OXM1的表達情況如何？目前尚不清楚。本研究旨在探討SAP/ALI小鼠肺損傷修復過程中FOXM1的表達變化及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康無特定病原體級BALB/c小鼠，雄性，月齡2～3個月，體重（26.0±2.0）g，由南華大學動物實驗中心提供并飼養(yǎng)，動物合格證號：SYXK（湘）2016-0009。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（25.0±0.5）℃，相對濕度為50%，自由飲食進水，晝夜光照節(jié)律。適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗，實驗前12 h禁食，自由飲水。所有實驗過程嚴格遵循中華人民共和國科學技術部《“關于善待實驗動物的指導性意見”》中有關倫理學的規(guī)定。

1.1.2 主要試劑 雨蛙肽（美國Sigma公司），HE染色試劑盒、0.5%伊文斯藍（evans blue, EB）、去離子甲酰胺溶液購自北京索萊寶生物科技有限公司，增強型RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、凝膠制備試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗FOXM1多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Abcam公司，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（美國Proteintech公司），Trizol Reagent（美國Life Technologies公司），Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國 Thermo Scientific公司），SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plius）（日本TaKaRa公司）。各引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 全自動生化分析儀（美國Rayto公司），生物組織自動脫水機（孝感亞光醫(yī)用電子技術公司），石蠟包埋機、石蠟切片機購自德國Leica公司，熒光顯微鏡（日本Olympus公司），臺式高速冷凍離心機（德國Hermle公司），多功能酶標儀（美國Thermo Scientific公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）儀（德國艾本德公司），電泳儀、轉膜儀、PCR擴增儀、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，核酸蛋白濃度測定儀（英國Bio-Drop公司），恒溫干燥箱（上海福碼實驗設備有限公司），精密電子天平（日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的復制與分組 將BALB/c小鼠按照隨機數(shù)字表隨機分為假手術組（10只）和模型組（50只），模型組小鼠又隨機分為模型組1、3、7、10和14 d 5個亞組，每組10只。參照GERARD等[5]的方法，采用10 mg/kg雨蛙肽腹腔注射小鼠，1次/h，連續(xù)注射8次，復制SAP/ALI小鼠模型。假手術組用等體積的0.9%生理鹽水腹腔注射。模型復制后死亡的動物予以隨機替補。

1.2.2 標本采集 模型組分別在復制后1、3、7、10和14 d，假手術組在復制后14 d，動物處死前3 h，隨機取5只小鼠，參照MUHS等[6]的方法尾靜脈注射0.5% EB溶液（10 ml/kg），30 min后用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔注射麻醉小鼠，開胸后用4℃、0.9%生理鹽水將肺內血液灌洗干凈。將注射EB小鼠的左肺組織用于EB含量的測定，右肺組織用于肺含水量的測定。其余5只小鼠抽取左心室動脈血，將左肺上葉和左肺下葉分離，迅速放入液氮中，分別用于qRTPCR和Western blotting檢測；右肺組織放入4%多聚甲醛中固定，用于HE染色。

1.2.3 HE染色與病理學評分 將固定好的肺組織送至南華大學附屬第一醫(yī)院病理科，進行脫水、透明、浸蠟、包埋，4μm厚連續(xù)冠狀切片，烤片后常規(guī)脫蠟至水化，行HE染色，脫水至透明，中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察。肺組織的病理學評分標準參照HOFBAUER等[7]的方法，根據(jù)水腫、炎癥細胞浸潤和出血情況對肺組織損傷進行評分，總分9分。采用盲法由本院2位病理科醫(yī)師單獨評分，每只動物隨機取5張切片，每張切片隨機觀察5個200倍視野，取其平均分作為肺組織病理學評分結果，代表相應組小鼠肺組織損傷程度。

1.2.4 血清淀粉酶、肺微血管通透性及肺組織含水量檢測 將小鼠血液在4℃條件下3 000 r/min離心10min，分離血清，用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶濃度。用濾紙吸干含有EB的肺組織表面的水分，稱取肺濕重，勻漿后浸泡于去離子甲酰胺溶液中（2 ml/100 mg肺濕重），60℃孵育24 h，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，用酶標儀于620 nm波長處測定上清液吸光度，根據(jù)標準曲線換算出肺組織中EB含量，結果以mg/L表示，用來代表肺微血管通透性。使用干/濕重法測定肺組織含水量。將相應肺組織稱取濕重后，置于60℃恒溫干燥箱中烘干，稱取干重。按以下公式計算肺組織含水量：肺組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.5 qRT-PCR 取液氮中的相應肺組織50～100 mg，用Trizol法提取組織總RNA，以Oligo（dT）18為引物，采用兩步法將總RNA逆轉錄為cDNA。引物采用Primer 6.0軟件設計，F(xiàn)OXM1正向 引 物 ：5’-ACCAGAAAGGGCTTTCCTCC-3’， 反向 引 物：5’-GTTGGGCCCCACTCTACCTT-3’， 退火溫度60℃，產物長度155 bp；β-actin正向引物：5’-GCAGATGTGGATCAGCAAGC-3’，反 向 引物：5’-AGGGTGTAAAACGCAGCTCAG-3’， 退 火溫度62℃，產物長度102 bp。qRT-PCR反應體系為20μl：2×SYBR Green Mix 10μl，cDNA 2μl，引物對1μl，Rox 0.4μl，RNase-free water 6.6μl。采用 qRTPCR儀進行擴增，反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，58～62℃退火1 min，共循環(huán)40次。熔解曲線反應條件：95℃15 s，60℃15 s，溫度緩慢上升（20 min），95℃15 s。內參基因選用β-actin，采用2－△△Ct法計算FOXM1 mRNA相對表達量?！鰿t=CtFOXM1-Ctβ-actin，△△ Ct=Ct模型組-Ct假手術組。

1.2.6 Western blotting檢測 取液氮中的相應肺組織50～100 mg，用蛋白抽提試劑盒提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳90 min，濃縮膠30 V恒壓30 min，分離膠60 V恒壓60 min，4℃環(huán)境下300 mA恒流轉膜，F(xiàn)OXM1轉膜時間為104 min、GAPDH為56 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入相應一抗，4℃搖床孵育過夜，復溫1 h，TBST快速洗滌3次，10 min/次。加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST快速洗滌3次，10 min/次。用ECL顯色，化學發(fā)光系統(tǒng)成像觀察。內參蛋白選用GAPDH。用Image J軟件進行平均灰度值分析。采用2－△△Ct法計算FOXM1蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件和Graph Pad Prism 5作圖軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，相關性分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠死亡情況

模型復制后，假手術組BALB/c小鼠未見死亡；模型組1 d死亡2只；模型組3、7、10和14 d各死亡3只。

2.2 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學變化

假手術組小鼠肺組織結構基本正常。模型組1、3、7、10和14 d各時間點肺間質和肺泡壁均有不同程度水腫、充血及炎癥細胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡腔出現(xiàn)滲出液，部分肺泡結構破壞，肺組織不同程度出血，其中復制后1 d時損害最嚴重，然后逐漸恢復。假手術組，以及模型組1、3、7、10和14 d肺組織病理學評分分別為（0.11±0.08）、（7.22±0.34）、（5.83±0.18）、（4.18±0.24）、（3.79±0.12） 和（2.80±0.09） 分，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.675，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，模型組各時間點肺組織病理學評分高于假手術組（P＜0.05）。見圖1、2。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片 （HE×200）

圖2 各組小鼠肺組織病理學評分比較 （±s）

2.3 各組小鼠血清淀粉酶、肺組織EB含量和含水量變化

假手術組小鼠血清中含有一定量淀粉酶，肺組織含有極少量的EB滲出和一定量的水分；各組小鼠血清淀粉酶、肺組織EB含量和含水量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，與假手術組比較，模型組1、3、7、10和14 d血清淀粉酶、肺組織EB含量和含水量不同程度升高（P＜0.05），其中復制后1 d時血清淀粉酶、肺組織EB含量和含水量最高（P＜0.05），隨后不斷降低（P＜0.05），但復制后14 d仍未完全恢復正常（P＜0.05）。見附表。

附表 各組小鼠血清淀粉酶、肺組織EB含量和含水量變化 （n =5，±s）

附表 各組小鼠血清淀粉酶、肺組織EB含量和含水量變化 （n =5，±s）

注：?與假手術組比較，P ＜0.05

組別 血清淀粉酶/（u/L） 肺組織E B含量/（m g/L） 肺組織含水量/%假手術組 1 3 1 4.3 8±1 8 6.5 1 0.0 9±0.0 1 6 0.5 2±2.1 1模型組1 d 1 9 8 9 4.2 1±3 2 5 4.1 3? 4.2 1±0.4 6? 8 1.3 6±1.5 3?模型組3 d 1 2 3 1 6.2 1±1 1 9 6.6 7? 3.6 5±0.2 1? 7 5.4 9±1.3 7?模型組7 d 7 8 7 9.9 8±6 8 3.5 3? 2.8 7±0.1 3? 6 8.2 8±1.4 6?模型組1 0 d 5 9 3 2.2 5±3 1 6.3 9? 1.5 4±0.0 9? 6 5.7 7±0.8 6?模型組1 4 d 4 5 1 6.1 3±2 1 1.6 8? 1.2 1±0.0 7? 6 3.0 5±0.6 1?F值 1 1.4 3 2 3.2 3 7 2.2 2 1 P值 0.0 0 0 0.0 0 1 0.0 0 3

2.4 各組小鼠FOXM1 mRNA表達水平

假手術組FOXM1 mRNA具有一定量的表達（1.00±0.09）， 模 型 組 1、3、7、10和 14 d FOXM1 mRNA相對表達量分別為（0.60±0.082）、（1.24±0.11）、（2.70±0.18）、（2.01±0.19） 和（1.13±0.13），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.173，P=0.001）。進一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，與假手術組比較，模型組1 d的FOXM1 mRNA表達下調（P＜0.05）；與假手術組比較，模型組3 d開始FOXM1 mRNA相對表達逐漸上調（P＜0.05），第7天達高峰（P＜0.05），10 d時開始恢復（P＜0.05），14 d時基本回到基礎水平（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠FOXM1 mRNA表達水平比較（n =5，±s）

2.5 各組小鼠FOXM1蛋白表達水平

假手術組FOXM1蛋白具有一定量的表達（0.30±0.02），模型組1、3、7、10和 14 d FOXM1蛋白相對表達量分別為（0.18±0.01）、（0.42±0.05）、（0.89±0.03）、（0.61±0.07） 和（0.31±0.04）， 經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=8.542，P=0.003）。進一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，與假手術組比較，模型組第1天FOXM1蛋白表達下調（P＜0.05）；與假手術組比較，3 d時FOXM1蛋白表達開始逐漸上調（P＜0.05），7 d時達高峰（P＜0.05），10 d時開始恢復（P＜0.05），14 d時基本回到基礎水平（P＞0.05），表達規(guī)律與FOXM1 mRNA相似。見圖4。

2.6 各組小鼠FOXM1蛋白與肺微血管通透性的相關性

采用Spearman等級相關性分析的方法分析SAP/ALI小鼠模型復制后不同時間點FOXM1蛋白表達與肺微血管通透性（肺組織EB含量）的相互關系。結果顯示，復制后1 d，兩者呈負相關（rs=-0.859，P=0.008）；復制后3和7 d，兩者呈負相關（rs=-0.984和-0.924，P=0.001和0.003）；復制后10和14 d，兩者呈正相關（rs=0.871和0.862，P=0.002和 0.006）。

圖4 各組小鼠FOXM1蛋白表達的變化

3 討論

本研究采用雨蛙肽誘導SAP/ALI小鼠模型，發(fā)現(xiàn)復制后各時間點血清淀粉酶升高，肺組織病理形態(tài)發(fā)生改變，在第1天達高峰，然后隨著時間的推移而不斷減輕，肺微血管通透性和肺組織含水量變化規(guī)律與肺組織損傷后病理形態(tài)改變相似，提示SAP并發(fā)ALI后肺組織自身存在一定的自我損傷修復能力，肺氣血屏障的破壞與修復可能在其中扮演關鍵角色。同時，在損傷修復過程中發(fā)現(xiàn)肺組織FOXM1 mRNA表達具有明顯的動態(tài)演變規(guī)律，復制后第1天表達下調，隨后逐漸上調，第7天達高峰，隨后逐漸恢復，第14天時基本回到基礎水平；Western blotting檢測FOXM1蛋白水平也有相似的表達規(guī)律。另外，通過對FOXM1蛋白表達與肺微血管通透性進行相關性分析，結果顯示在肺組織損傷修復過程中，復制后1 d時，兩者呈負相關；術后3和7 d，兩者呈負相關；復制后10和14 d，兩者呈正相關，表明FOXM1可能參與SAP/ALI過程中肺氣血屏障的損傷與修復。

肺氣血屏障通透性增加是ALI發(fā)生并進展到急性呼吸窘迫綜合征的必然過程，SAP/ALI典型的病理改變是肺微血管內皮損傷，導致其通透性增加，造成肺間質水腫，甚至肺泡水腫。研究表明，肺微血管屏障功能紊亂在SAP/ALI發(fā)生中起重要作用，當微血管滲透性急劇增加時，大量液體滲入肺組織間隙，造成嚴重肺水腫，進一步出現(xiàn)肺泡結構的破壞[2]。因此，尋求有效的糾正肺氣血屏障功能紊亂的藥物作用分子靶點，對于降低SAP/ALI患者臨床病死率具有重要的意義。

FOXM1是Fox家族轉錄因子之一，與細胞增殖密切相關，能特異性的表達于增殖期細胞中，而在細胞終末分化時消失[8]。近年來大量文獻報道，在肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中，F(xiàn)OXM1均高表達[9-10]。同時有研究表明，使用siRNA干擾的方法抑制FOXM1激活后，能夠阻止損傷后的肺微血管內皮細胞增殖[11]。但有趣的是，WANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在Rosa26-FOXM1轉基因小鼠模型中，即使觀察到FOXM1蛋白定位于細胞核中，細胞增殖并未見增加。綜合以上研究結果，筆者推斷，在正常情況下，F(xiàn)OXM1既可促進細胞增殖，但又在一定程度上存在某種機制來調控自身，以防止FOXM1的異常上調，使細胞異常增殖，最終出現(xiàn)惡變，F(xiàn)OXM1可能是SAP/ALI后微血管內皮細胞增殖和功能維持的關鍵分子。為證明該假設，本研究通過qRT-PCR和Western blotting檢測SAP/ALI小鼠肺損傷修復過程中FOXM1 mRNA和蛋白的表達及其演變規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在肺損傷修復過程中，F(xiàn)OXM1表達總體被激活，在一定范圍內上調，且與肺微血管通透性具有相關性，達一定水平后逐漸下調恢復，進一步說明FOXM1在SAP/ALI肺損傷修復過程中發(fā)揮重要作用，可能通過有限度地促進肺微血管內皮細胞增殖來修復損傷的血屏障損，又不至于導致肺組織惡變。

而關于在損傷后第1天內，F(xiàn)OXM1表達水平與肺氣血屏障通透性不一致的原因尚不清楚，可能是在急性胰腺炎相關的肺損傷發(fā)生過程中，肺內炎癥因子、凋亡因子等大量表達，肺內損傷因素占主導，此時氣血屏障被破壞，F(xiàn)OXM1表達被這些損害因素所抑制，內皮細胞發(fā)生壞死或凋亡為主，但具體的分子機制有待進一步研究。

本研究也存在一些不足，損傷后的肺組織內存在多種細胞，如肺泡上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞，以及各種炎癥細胞等，課題組沒有進一步區(qū)分FOXM1在肺微血管內皮細胞中的表達情況，而通過免疫熒光雙標的方法或體外培養(yǎng)肺微血管內皮細胞模擬SAP/ALI微環(huán)境來檢測其表達變化規(guī)律會更有說服力?？傊?，本研究初步探討SAP/ALI修復過程中FOXM1的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1可能在促進SAP/ALI肺氣血屏障的修復過程中發(fā)揮重要作用，是新的潛在靶點，但其具體是通過何種分子機制實現(xiàn)對自身的調控，還需要更深入的研究來闡明。