劉 華 ，何長生 ，占松鶴 ，陳 曦 ，朱良強 ，陳海林 ，祁克宗，鄭 舉，沈 艷，周迎春，王 倩，王 維，王 軍

（1. 安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 230061；2. 安徽省獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控重點實驗室，安徽合肥 230036；3. 安徽省畜牧獸醫(yī)局，安徽合肥 230001）

禽流感（Avian In fluenza，AI）是由A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病，最早于100多年前報道于意大利，此后在世界各地不斷報告發(fā)生[1]。A型禽流感病毒（AIV）中有15種亞型能感染禽類，其中部分H5和H7亞型具有高致病性，并可感染人類[2-3]，因此世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將高致病性禽流感（HPAI）列為必須通報的動物疫病，我國將其列為一類動物傳染病。安徽省曾發(fā)生過多起H5N1亞型HPAI疫情，也曾分離出2013年全球首株H7N9流感病毒。安徽省水網(wǎng)湖泊眾多，水禽養(yǎng)殖密度大，候鳥和家禽接觸頻繁，而且活禽交易規(guī)模大、分布廣，再加上本地人有喜食現(xiàn)宰活禽的消費習(xí)慣，因而更增加了該地區(qū)活禽和人類感染AIV的風(fēng)險。為了解安徽省A型AIV感染情況，掌握全省高風(fēng)險區(qū)AIV的分布現(xiàn)狀，找出重點防控環(huán)節(jié)，2018年4—5月，在安徽省高風(fēng)險區(qū)域開展了A型AIV檢測，檢測范圍覆蓋了養(yǎng)殖場、活禽交易市場、農(nóng)貿(mào)市場、屠宰場以及散養(yǎng)戶等多個場點，以期為安徽省AI防控方案的制訂提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 目標(biāo)群

根據(jù)往年國家參考實驗室對安徽省的AI監(jiān)測陽性結(jié)果，選擇宿州、阜陽、合肥、六安、滁州、宣城、蕪湖等7個市作為本次研究的重點監(jiān)測區(qū)域，將這7個市的家禽作為目標(biāo)群。

1.2 抽樣策略和樣本量

采取先抽取群體，再抽取個體的抽樣策略。用估計流行率方法，預(yù)設(shè)13%的群體流行率（p），95%置信水平（CL）和5%可接受誤差（d），根據(jù)公式N=1.962×p(1-p)/d2計算，共需抽檢174個場群。參考安徽省畜牧獸醫(yī)局統(tǒng)計數(shù)據(jù)，根據(jù)種禽場、商品蛋禽場、商品肉禽場、活禽流通場所（包括批發(fā)、零售和屠宰場）、散養(yǎng)禽等各種類型場點的比例，對需抽檢的場群進(jìn)行數(shù)量分配，并隨機選場。在每個群內(nèi)，按照估計流行率方法，預(yù)設(shè)個體流行率為10%、置信水平95%和可接受誤差10%，隨機采集35份個體樣品。

1.3 樣品采集和檢測

用棉簽在養(yǎng)殖場內(nèi)隨機采集家禽咽喉/泄殖腔雙拭子35份；在活禽批發(fā)/零售市場采集5個檔口或攤位，每個采5份家禽雙拭子，同時在每個市場采10份環(huán)境拭子，在屠宰場采集家禽雙拭子25份和環(huán)境拭子10份，在每個自然村采集散養(yǎng)家禽雙拭子35份。

將背景信息相同的5份樣品混合成1份混樣，用A型AIV熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測，只要檢測到1份混樣為A型通用型AIV核酸陽性，則該樣品所在的場點就被定義為A型AI陽性場點。對A型陽性樣品，再用H5/H7二重核酸熒光RTPCR試劑盒進(jìn)行分型檢測。所有RT-PCR試劑均為深圳澳東檢驗檢測有限公司產(chǎn)品。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 群體流行率 用黃保續(xù)等[4]的方法，對分層得到的陽性率直接標(biāo)準(zhǔn)化計算，并與檢測試驗敏感性（Se）、特異性（Sp）、群體內(nèi)個體抽樣的數(shù)量（n），帶入公式 HSe=1?[1?p×Se?(1?p)(1?Sp)]n和 HSp=Spn，HTp=(HAp+HSp?1)/(HSe+HSp?1)，計算出群敏感性（HSe）和群特異性（HSp）和群體真實流行率（HTp）。群體流行率的95%置信區(qū)間（CI）根據(jù)公式計算：，其中Z為正態(tài)分布中概率為0.05所對應(yīng)的值1.96，N為群體抽樣數(shù)量。

1.4.2 個體流行率估計 根據(jù)混合樣品檢測結(jié)果，用Epitools流行病學(xué)在線計算器估算個體流行率[5-6]。

2 結(jié)果

2.1 A型AIV流行率估計

根據(jù)安徽省7市種禽場、商品蛋禽場、商品肉禽場、活禽批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場、屠宰場、散養(yǎng)禽等各層所占比例，將各層陽性率按所占比例進(jìn)行加權(quán)計算。結(jié)果顯示，安徽省7市A型AIV群體表觀流行率為13.9%，標(biāo)準(zhǔn)化率為14.1%（95%CI：10.9%～17.4%）。

根據(jù)A型AIV熒光RT-PCR診斷試劑盒的試驗敏感性（Se=99%）和特異性（Sp=99.9%），計算出HSe=99.2%，HSp=96.6%，得到安徽省7市A型AIV群體真實流行率為11.2%（95%CI：6.5%～15.8%）。

表1 安徽省7市A型AIV場群抽樣數(shù)據(jù)和群體流行率

個體水平，共采集咽 / 喉泄殖腔棉拭子樣品6 050份；將5份背景信息相同樣品混合，共得到了1 210份混樣，檢測發(fā)現(xiàn)71份混樣為A型AIV核酸陽性。用Epitools流行病學(xué)計算器，算得個體流行率為1.2%（95%CI：0.9%～1.5%）。

表2 不同場點類型A型AIV個體抽樣數(shù)據(jù)和個體流行率

2.2 空間分布

在安徽省北部、中部和南部，隨機選擇了7個市15個縣（市、區(qū)）進(jìn)行抽樣檢測。檢測結(jié)果顯示，7個市11個縣（市、區(qū)）均檢出A型AIV核酸陽性（圖1）。

2.3 群間分布

圖1 安徽省7市A型AIV橫斷面研究采樣場點與陽性點

2.3.1 不同類型場群 140個養(yǎng)禽場中，檢出4個A型AIV核酸陽性，分別是1個種禽場（1/21）、2個蛋禽場（2/49）和1個肉禽場（1/70），場陽性率為2.9%，經(jīng)Fisher精確檢驗，檢出陽性率差異不顯著（P＞0.05）。25個活禽交易場所中，批發(fā)市場（3/4）和農(nóng)貿(mào)市場（17/21）A型AIV核酸陽性率較高，分別為75.0%和80.9%，經(jīng)Fisher精確檢驗，兩者檢出陽性率差異不顯著（P＞0.05）。2個活禽屠宰場和6個自然村散養(yǎng)戶均未檢出A型陽性。對養(yǎng)禽場、活禽市場、屠宰場和散養(yǎng)村戶的陽性率進(jìn)行兩兩比較，經(jīng)Fisher精確檢驗，發(fā)現(xiàn)活禽市場與養(yǎng)禽場的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），活禽市場感染A型AIV的風(fēng)險是養(yǎng)禽場的136倍（OR=136，95%CI：32.7～549.4）。

2.3.2 不同樣品來源 140個養(yǎng)禽場中，3個雞場（3/110）和1個鴨場（1/13）被檢出陽性，鵝場未檢出陽性（0/17），經(jīng)Fisher精確檢驗，雞場和鴨場間的檢出陽性率差異不顯著（P＞0.05）。混合樣品陽性率分別是雞0.8%（6/770）、鴨1.1%（1/91）、鵝0（0/119），經(jīng)Fisher精確檢驗，檢出陽性率差異不顯著（P＞0.05）?；钋菔袌鲋校旌蠘悠逢栃月史謩e是雞39.1%（34/87）、鴨39.3%（11/28）、鵝50.0%（2/4）、鴿子66.7%（2/3），經(jīng)Fisher精確檢驗，檢出陽性率差異不顯著（P＞0.05）。 環(huán)境樣品檢出率為37.5%（3/8），農(nóng)貿(mào)市場為45.2%（19/42），經(jīng)Fisher精確檢驗，檢出陽性率差異不顯著（P＞0.05）。具體檢測結(jié)果見表3。

表3 A型 AIV 群間分布情況

2.4 病毒分型

對A型AIV核酸陽性的樣品，進(jìn)行H5和H7亞型分型，發(fā)現(xiàn)H5和H7亞型均呈陰性。

3 討論

此次橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，A型AIV個體流行率較低，但群體感染率較高，真實流行率為11.2%（95%CI：6.5%～15.8%），從空間分布看，沒有地域上的差異，表明A型AIV在這些地區(qū)分布十分廣泛。

從群間分布看，活禽交易環(huán)節(jié)的檢出率較高，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、屠宰環(huán)節(jié)較低。在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，種禽、蛋禽、肉禽場中均有檢出，但差異不顯著，雞、鴨、鵝、鴿子中的檢出陽性率也沒有顯著差異，說明A型AIV感染沒有養(yǎng)殖場點類型和家禽種類的差異?；钋萁灰篆h(huán)節(jié)的AIV感染風(fēng)險比其他環(huán)節(jié)高，這與國內(nèi)諸多省份的檢測結(jié)果一致[7-11]。

2004年開始，我國對H5亞型AI實行強制免疫，2017年又決定對H7N9亞型實行強制免疫[12]。2017年下半年，安徽省將重組（H5+H7）二價滅活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）用于秋季強制免疫。本次檢測的H7亞型病毒呈核酸陰性可能與之有關(guān)。陳化蘭院士團隊的研究結(jié)果顯示，雞接種（H5+H7）二價滅活苗前后，H7N9亞型流感病毒分離數(shù)量由306株下降至15株[13]。此外，在H7N9亞型疫苗投入使用后，全國人間感染病例數(shù)量顯著下降，安徽省尚未見人間病例報道。這都表明疫苗免疫在阻斷H7N9病毒向家禽和人的傳播中起到了關(guān)鍵作用。

雖然本次檢測未檢出H7亞型病毒，但2017年8月滁州市曾報道在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn)H7N9變異株感染雞的病例，因此建議按照《全國家禽H7N9流感防治指導(dǎo)意見（2018—2020年）》要求，繼續(xù)加大監(jiān)測力度。H9N2病毒雖然是低致病性的，但有研究顯示，其在A型流感病毒向人傳播中扮演重要角色[14-16]。鑒于此，下一步將對A型AIV核酸陽性樣品進(jìn)行H9亞型病毒檢測。本次檢測發(fā)現(xiàn)，活禽市場環(huán)境樣品的AIV檢出率較高，因此建議加強活禽市場監(jiān)管，按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部防治指導(dǎo)意見，落實好“1110”制度（一日一清洗、一周一消毒、一月一休市、過夜零存欄），有條件的地方，應(yīng)積極推行冰鮮上市，降低病毒在活禽交易環(huán)節(jié)的傳播風(fēng)險。

4 結(jié)論

本次檢測發(fā)現(xiàn)，A型AIV在養(yǎng)殖和交易環(huán)節(jié)存在一定污染，而在活禽交易市場的污染更為嚴(yán)重，是今后AI防控的重點，需繼續(xù)加強活禽交易市場的管理和消毒滅源工作。