陸悅倩，田 曼，王宏偉

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.無錫市兒童醫(yī)院，江蘇 無錫 214000；3.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210093)

過敏性哮喘是兒童最常見的慢性過敏性疾病。該病是指以慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道阻塞為特征的慢性疾病[1]。過敏性哮喘的發(fā)病主要與遺傳因素、接觸變應(yīng)原(如螨蟲、粉塵、花粉等)及某些促發(fā)因素(空氣污染、吸煙、呼吸道感染)等有關(guān)。該病患兒若未能及時(shí)接受有效的治療，可發(fā)生阻塞性肺氣腫、慢性肺源性心臟病、呼吸衰竭等嚴(yán)重的并發(fā)癥[2]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)是一種促炎性細(xì)胞因子。sIL-6R是IL-6受體(IL-6R)經(jīng)蛋白質(zhì)水解后形成。有研究表明，sIL-6R與IL-6結(jié)合后，仍能介導(dǎo)IL-6的生物學(xué)功能。Treg是T淋巴細(xì)胞群中表達(dá)CD4、CD25、Foxp3等特異性表面標(biāo)志物的淋巴細(xì)胞亞群，其可以有效地抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的功能及增殖。本文主要探討sIL-6R與Treg在兒童過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制中的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將在南京市兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診接受治療的214例過敏性哮喘患兒和同期在該醫(yī)院外科接受疝囊高位結(jié)扎術(shù)的196例腹股溝斜疝患兒作為研究對(duì)象。將196例腹股溝斜疝患兒作為對(duì)照組，將214例過敏性哮喘患兒作為哮喘組。在對(duì)照組患兒中，有男84例，女112例；其年齡為4～13歲，平均年齡為(7.1±1.2)歲。在哮喘組患兒中，有男119例，女95例；其年齡為3～14歲，平均年齡為(7.2±1.9)歲。兩組患兒的一般資料相比，P＞0.05，具有可比性。

1.2 研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)是：1)哮喘組患兒的病情符合《實(shí)用兒科學(xué)》中關(guān)于哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并被確診。2)哮喘組患兒進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)的結(jié)果均為陽性。3)患兒的監(jiān)護(hù)人同意讓患兒參加本次研究，并簽署了知情同意書。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：合并有過敏性皮炎、過敏性紫癜、過敏性休克的患兒。

1.3 方法

對(duì)兩組患兒均進(jìn)行靜脈采血。應(yīng)用BioTEK酶標(biāo)儀檢測兩組患兒血漿中IL-6、sIL-6R的水平。應(yīng)用BioTEK酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測的方法是：1)采集兩組患兒的靜脈血4 ml。2)對(duì)兩組患兒的靜脈血進(jìn)行離心處理，將離心機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為3000 r/min，將離心半徑設(shè)置為10 cm。進(jìn)行離心的時(shí)間為15 min。3)提取上清液。4)應(yīng)用BioTEK酶標(biāo)儀，按照IL-6 ELISA試劑盒(生產(chǎn)企業(yè)為北京翹神州生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)品型號(hào)為SEK10398)及IL-6免疫測定試劑盒(生產(chǎn)企業(yè)為美國圣地亞哥eBioscience公司)的要求，采用ELISA法在2 h內(nèi)對(duì)患兒血漿標(biāo)本中IL-6、sIL-6R的水平進(jìn)行檢測。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測兩組患兒外周血中Treg的含量。檢測的方法是：1)使用人淋巴細(xì)胞分離液通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從全血中分離出PBMC(Peripheral blood mononuclear cell，外周血單個(gè)核細(xì)胞)。2)將PBMC用2ml磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，在450xg條件下離心5分鐘后去除上清。3)以100ul磷酸緩沖溶液重懸細(xì)胞。4)加入CD4(FITC)、CD25(APC)熒光素標(biāo)記的抗人抗體，黑暗條件下4℃孵育至少30分鐘。5)將表面染色后的細(xì)胞直接加入1毫升的破膜/固定工作溶液(eBioscience公司)，黑暗條件下4℃孵育30min。6)無需洗滌，直接再加入2毫升1×破膜液(eBioscience公司)，在室溫400g*5分鐘下離心，洗滌、棄去上清液，細(xì)胞懸浮在200μL的PBS中，分裝至100ul/管流式細(xì)胞儀檢測管中。7)分別加入FoxP3熒光素標(biāo)記的流式抗體和抗人的iso-型對(duì)照抗體，并在黑暗的室溫環(huán)境中進(jìn)行60min染色。8)最后用FACS溶解液(BD Pharmingen公司)洗滌并固定細(xì)胞，再次進(jìn)行400g*5min離心處理。9)離心結(jié)束后，棄上清，加入0.5 ml的磷酸緩沖鹽溶液，充分混勻后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測Treg的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Flowjo 7.6.1軟件對(duì)本次研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，Treg的含量、sIL-6R的水平、IL-6的水平均采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-Whitney U-test)，計(jì)數(shù)資料用百分比(%)表示，數(shù)值變量之間的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)。本次研究所得數(shù)據(jù)均符合Hardy-Weinberg平衡定律，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒血漿中IL-6、sIL-6R水平的比較

與對(duì)照組患兒相比，哮喘組患兒血漿中IL-6、sIL-6R的水平更高，P＜0.05，詳見表1。哮喘組患兒血漿中IL-6、sIL-6R水平的異常升高與其機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)具有顯著的相關(guān)性(R=0.23，P＜0.01)。詳情見圖1。

表1 兩組患兒血漿中IL-6、sIL-6R水平的比較(pg/ml ，)

表1 兩組患兒血漿中IL-6、sIL-6R水平的比較(pg/ml ，)

哮喘組(n=214)對(duì)照組(n=196) t值 P值IL-6的水平 41.30±3.52 26.50±2.14 3.538 0.0005 sIL-6R的水平 41940±1013 34010±108 5.276 ＜0.0001

2.2 兩組患兒外周血中Treg含量的比較

與對(duì)照組患兒相比，哮喘組患兒外周血中Treg的含量更低，P＜0.01，詳見表2。兩組患兒血漿中IL-6的水平與其外周血中Treg的含量無相關(guān)性，但其血漿中sIL-6R的水平與其外周血中Treg的含量呈負(fù)相關(guān)(R=0.183，P＜0.01)。詳情見圖2。

表2 兩組患兒外周血中Treg含量的比較(%，)

表2 兩組患兒外周血中Treg含量的比較(%，)

對(duì)照組(n=196) 哮喘組(n=214) t值 P值Treg 5.509±0.1614 3.914±0.2240 5.605 ＜0.0001

圖1 哮喘組患兒血漿中IL-6、sIL-6R的水平與其機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的相關(guān)性

圖2兩組患兒外周血中Treg的含量與其血漿中sIL-6R水平的關(guān)系

圖2 A∶Treg表面標(biāo)志物Foxp3(叉頭盒蛋白P3)為陽性的CD25陰性細(xì)胞流式散點(diǎn)圖(右上圖)；哮喘組患兒外周血中Treg表面標(biāo)志物CD25、Foxp3細(xì)胞流式散點(diǎn)圖(右下圖)；對(duì)照組患兒外周血中Treg表面標(biāo)志物CD25、Foxp3細(xì)胞流式散點(diǎn)圖(左下圖)。圖2B：兩組患兒外周血中Treg的含量。圖2C：兩組患兒外周血中Treg的含量與其血漿中sIL-6R的關(guān)系。

3 討論

IL-6是一種促炎性細(xì)胞因子。IL-6可由多種細(xì)胞合成，包括活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。有研究表明，IL-6在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、哮喘、糖尿病和癌癥等炎癥性疾病的發(fā)病中可發(fā)揮重要的作用[2]。sIL-6R是一種分子量為50～60 kDa的細(xì)胞膜糖蛋白，其與IL-6結(jié)合后，仍能介導(dǎo)IL-6的生物學(xué)功能。臨床實(shí)踐證實(shí)，哮喘患兒在受到過敏原刺激后其肺泡灌洗液中sIL-6R的水平明顯升高。Doganci A等[3]的研究表明，哮喘小鼠在受到過敏原刺激后其支氣管肺泡灌洗液中sIL-6R的水平明顯升高。由此可見，IL-6水平的異常升高與過敏性哮喘所致炎癥反應(yīng)具有顯著的相關(guān)性。有研究表明，血漿IL-6、sIL-6R水平可直接反映過敏性哮喘患兒的慢性炎癥過程。Treg具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，可有效地抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化和增殖。CD4、CD25、Foxp3均是Treg的表面標(biāo)志物。有研究表明，哮喘小鼠體內(nèi)的Treg可有效地抑制其氣道炎癥[4]。有研究表明，呼吸道病毒可通過雙鏈RNA進(jìn)行繁殖，誘導(dǎo)患者體內(nèi)IL-6的水平異常升高，從而抑制Treg免疫調(diào)節(jié)的功能[5]。通過建立哮喘小鼠模型發(fā)現(xiàn)，其體內(nèi)IL-6與sIL-6R結(jié)合后可抑制Treg的生成，當(dāng)sIL-6R水平異常升高后， Treg的含量明顯減少。本次研究的結(jié)果證明，可溶性白細(xì)胞介素-6受體水平的升高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量的降低均是導(dǎo)致兒童過敏性哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素。過敏性哮喘患兒血漿中sIL-6R的水平與其外周血中Treg的含量呈負(fù)相關(guān)。