胡亮亮，趙子瑤，張海強(qiáng)，陳菲帆，張朝文，戎福喜，陳 鵬，李玉紅

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要器官，葉色變化會(huì)影響植物的光合效率進(jìn)而影響產(chǎn)量，因此葉色變異方面的研究受到不少科研工作者的高度重視[1-2]。葉色突變體是研究葉色變異形成機(jī)制的理想材料, 被廣泛應(yīng)用于植物光合作用、光形態(tài)建成、葉綠體結(jié)構(gòu)功能與遺傳發(fā)育調(diào)控機(jī)制等研究中[3-5]。此外，葉色突變體也可作為標(biāo)記性狀用于輔助育種及雜一代種子的生產(chǎn)中[6-9]。

葉色突變體來(lái)源較廣，其產(chǎn)生方式主要有自然突變、插入突變和物理化學(xué)誘變等[10]。葉色突變體在水稻、玉米、小麥和大豆等作物中均有大量報(bào)道[5,11-14]，如在水稻上有200多個(gè)葉色突變體，其中有50多個(gè)葉色突變的候選基因被克隆[15]，玉米上已報(bào)道的葉色突變體超過(guò)210個(gè)[13]。在大豆上已定位了25個(gè)導(dǎo)致葉綠素缺陷的相關(guān)基因[12]。相比較以上植物，在黃瓜上有關(guān)葉色突變體的研究還相對(duì)滯后，只報(bào)道了10余個(gè)葉色突變體，如黃葉轉(zhuǎn)綠(v)、黃葉轉(zhuǎn)綠-1(v-1)、黃色子葉-1(yc-1)、黃色子葉-2(yc-2)、白化致死(pl)、白化轉(zhuǎn)綠(albin)、光敏白化致死突變(ls)、葉綠素缺陷突變(cd)、黃轉(zhuǎn)綠白斑葉(vvi)、金黃葉(yp)、金黃色子葉(gc)和黃綠葉(ygl)[16-20]，僅克隆到黃瓜的金黃葉突變體C528和黃綠葉突變體9110Gt的候選基因[19-21]，且對(duì)這些突變體的研究多集中在形態(tài)特征描述及遺傳規(guī)律分析方面，對(duì)其光合特性的研究報(bào)道較少，與大田作物如水稻、玉米等相比，報(bào)道的黃瓜葉色突變?nèi)匀缓苌伲h(yuǎn)不能滿足對(duì)其葉色突變機(jī)制的解析及利用。

西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的黃瓜黃化轉(zhuǎn)綠突變體C777。經(jīng)過(guò)連續(xù)3 a的種植觀察，發(fā)現(xiàn)該突變體能夠穩(wěn)定遺傳。本試驗(yàn)從葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、光合速率及葉綠素?zé)晒鈪?shù)等方面對(duì)突變體C777及其野生型CCMC進(jìn)行測(cè)定分析，旨在了解該突變性狀對(duì)光合作用效率的影響，為進(jìn)一步解析該突變體葉色變異的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為合理利用這一新種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃綠葉突變體C777由黃瓜自交系CCMC通過(guò)EMS化學(xué)誘變得到。該突變體子葉抽出時(shí)即為黃色，隨著第1片真葉的長(zhǎng)出，子葉慢慢轉(zhuǎn)綠。第1片真葉長(zhǎng)出時(shí)也為黃色，隨著第2片真葉的抽出慢慢轉(zhuǎn)綠，突變體整個(gè)生育期都表現(xiàn)出這種轉(zhuǎn)色現(xiàn)象。野生型CCMC葉色為綠色；突變體C777和野生型CCMC均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。2016-03-15將突變體和野生型種子各150粒播種于72孔穴盤(pán)中進(jìn)行育苗，4月10日定植于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場(chǎng)，株距25 cm，行距60 cm，試驗(yàn)設(shè)野生型和突變體2個(gè)處理，在幼苗的第4真葉期進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 用80%丙酮提取光合色素，參照Hill等[22]的方法用分光光度法分別測(cè)定葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。根據(jù) C777 葉色由黃轉(zhuǎn)綠的時(shí)間，取樣和測(cè)定指標(biāo)時(shí)分2個(gè)時(shí)期，即 C777黃化期和轉(zhuǎn)綠后，分別用時(shí)期Ⅰ和時(shí)期Ⅱ來(lái)表示。突變體和野生型各重復(fù)3次，每次重復(fù)測(cè)定10株。

1.2.2 突變體C777光合相關(guān)參數(shù)的測(cè)定 利用Li-6800(美國(guó)LI-COR 公司)型便攜式植物光合測(cè)定儀，在晴朗天氣9:00-11:00時(shí)間段內(nèi)，開(kāi)始測(cè)定幼苗功能葉(從頂芽往下數(shù)第2和第3片葉)的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、葉片氣孔導(dǎo)度(Gs)和胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)(Ci)。光強(qiáng)設(shè)置為1 000 μmol·m-2·s-1，CO2注入系統(tǒng)設(shè)定值為400 μmol·mol-1，氣體流量為500 μmol·s-1。葉片溫度及其周圍的水氣壓分別為(29±1)℃和(1.7±0.1) kPa。分別測(cè)定突變體Ⅰ期和 Ⅱ期的光合相關(guān)參數(shù)。重復(fù)3次，每次重復(fù)測(cè)定3株。

用Fc800 FluorCam大型版開(kāi)放式多光譜熒光成像系統(tǒng)(捷克PSI公司)對(duì)轉(zhuǎn)色前的突變體和野生型的離體葉片進(jìn)行熒光成像分析。通過(guò)成像情況來(lái)直觀地比較突變體和野生型葉片的最大光量子產(chǎn)量QYmax(即Fv/Fm)之間的差異。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Execl 2007和SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與顯著性分析，處理間顯著性分析采用Duncan’s法(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體C777的光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由表1可以看出，在Ⅰ期，C777的總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50 mg·g-1，顯著低于野生型。突變體葉片的各光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也均顯著低于野生型。葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素分別為野生型葉片相應(yīng)色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的27.27%、23.53%、26.46%和40.00%。在Ⅱ期，突變體C777葉片轉(zhuǎn)綠之后，各光合色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高，C777總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比轉(zhuǎn)色前葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高3.5倍，但與野生型相比，仍略低于野生型。葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素以及類胡蘿卜素為野生型相應(yīng)色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的82.95%、75.00%、81.11%和83.33%，由于葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化幅度顯著高于類胡蘿卜素(表1)，由此初步推斷葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化是引起突變體葉色變化的主導(dǎo)色素，該黃瓜黃綠葉突變體為總?cè)~綠素缺陷型突變體。突變體C777在Ⅰ期和Ⅱ期葉綠素a/b均大于野生型，分別為5.00和4.87。

表1 黃瓜葉色突變體C777葉片光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相對(duì)比值Table 1 Photosynthetic pigment mass fraction and relative ratio of leaf color mutant C777

注：數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。不同小寫(xiě)字母表示突變體與野生型差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Data are “means±SD”.Different lowercase letters indicate significant difference between mutant and wild type(P<0.05). The same below.

2.2 光合速率及相關(guān)參數(shù)分析

由表2可知，在Ⅰ期和Ⅱ期，突變體的Pn均顯著低于野生型，分別為野生型的58.68%和81.50%。推測(cè)在Ⅰ期由于突變體葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，使得其捕光能力降低，最終導(dǎo)致凈光合速率低于野生型。Ⅱ期突變體葉片呈現(xiàn)黃綠色，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然有所上升，但凈光合速率仍低于野生型。

突變體C777在 Ⅰ期和Ⅱ期，Ci顯著高于野生型，分別高出81.41和47.13 μmol·mol-1。表明突變體對(duì)CO2的利用率較野生型低，這與兩者之間Pn的表現(xiàn)一致。突變體Gs在Ⅰ期和Ⅱ期均比野生高，分別高出0.13和0.18 mol·m-2·s-1，而蒸騰速率在兩者之間差異不顯著。

表2 黃瓜葉色突變體C777葉片的光合特性Table 2 Photosynthetic characteristics of leaf color mutant C777 in cucumber

2.3 突變體葉綠素?zé)晒鈪?shù)及成像分析

由表3可知，突變體光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)顯著低于野生型，為野生型的78.31%，說(shuō)明突變體的PSⅡ系統(tǒng)將捕獲的光量子轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的效率較野生型低。非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)反映了植株以熱能的形式耗散過(guò)剩光能的能力，突變體顯著高于野生型，比野生型高出0.24，這說(shuō)明突變體耗散過(guò)剩光能的能力較野生型強(qiáng)，通過(guò)耗散過(guò)剩的光能，突變體從而提高對(duì)自身光合系統(tǒng)保護(hù)的能力。突變體表觀光合電子傳遞速率(ETR)顯著低于野生型，為野生型的45.44%，說(shuō)明突變體在電子傳遞效率上低于野生型，對(duì)光能的利用低于野生型，這與光合測(cè)定結(jié)果相符。

利用Fc800 FluorCam大型版開(kāi)放式多光譜熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)突變體葉綠素?zé)晒獬上癖硇停l(fā)現(xiàn)突變體QYmax(即Fv/Fm)低于野生型(圖1)。表明突變體由于葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較野生型低，使得其PSⅡ的光能轉(zhuǎn)換效率降低，成像分析結(jié)果與用葉綠素?zé)晒鈨x所測(cè)結(jié)果相吻合。

表3 黃瓜黃綠葉突變體葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Chlorophyll fluorescence kinetic parameters of virescent leaf mutant in cucumber

3 討 論

目前，黃瓜上報(bào)道的黃綠葉突變體相對(duì)較少，主要有苗晗等[16]報(bào)道的突變體9110Gt和王家訓(xùn)等[25]報(bào)道的一個(gè)黃綠葉突變株系ygl。9110Gt只在第4真葉以前轉(zhuǎn)色明顯，以后黃化和轉(zhuǎn)色不突出[16]；突變株系ygl真葉先呈黃綠色然后轉(zhuǎn)為綠色[25]，而本試驗(yàn)的黃綠葉突變體C777在整個(gè)苗期都表現(xiàn)出轉(zhuǎn)色現(xiàn)象，且葉片先呈黃色然后轉(zhuǎn)綠，最終為黃綠色，其表型不同于9110Gt和ygl，因此認(rèn)為C777應(yīng)是一個(gè)新的黃瓜黃綠葉突變體。

A.突變體 Mutant;B. 野生型 Wild type

在光合色素方面，苗晗等[16]研究表明，黃瓜黃綠葉突變體9110Gt轉(zhuǎn)色前葉綠素及類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于野生型，但轉(zhuǎn)色后差異不顯著，而本試驗(yàn)的黃綠葉突變體C777 轉(zhuǎn)色前后的葉綠素及類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著低于野生型。此結(jié)果表明，C777的轉(zhuǎn)色機(jī)制可能不同于同為轉(zhuǎn)色突變體的9110Gt。本研究的黃綠葉突變體C777葉綠素a/b比值轉(zhuǎn)色前后均顯著高于野生型，說(shuō)明突變體C777葉綠素a和葉綠素b之間的轉(zhuǎn)換受到阻礙，使得葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，此結(jié)果與其他學(xué)者在水稻、小麥等作物的黃化轉(zhuǎn)綠突變體上的研究結(jié)果相同[11,26-27]，而不同于黃瓜黃綠葉突變體9110Gt[19]。突變體C777為黃色時(shí)(轉(zhuǎn)色前)類胡蘿卜素/總?cè)~綠素比值較野生型顯著降低，而轉(zhuǎn)為黃綠色后，其比值與野生型無(wú)顯著差異，表明類胡蘿卜素/與總?cè)~綠素比值變化不會(huì)導(dǎo)致C777葉片黃化，而總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低和升高是造成C777黃化和轉(zhuǎn)綠的主要原因。

光合色素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)直接或間接地影響植物的光合能力，具體表現(xiàn)在凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)等指標(biāo)發(fā)生變化。在此方面，有關(guān)黃瓜黃綠葉突變體的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)中突變體C777在 Ⅰ和Ⅱ期的凈光合速率均顯著低于野生型，胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)顯著高于野生型(表2)，與李萬(wàn)青等[21]在黃瓜葉色黃化突變體C528上的研究結(jié)果一致。不同的是突變體C777的氣孔導(dǎo)度在Ⅰ期和Ⅱ期均顯著高于野生型，蒸騰速率之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明突變體光合能力較低并非受氣孔和蒸騰速率影響，而是由于對(duì)CO2的利用率較低所致。

葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要器官，光合作用效率的高低與葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性有密切的關(guān)系。黃瓜全基因組序列的發(fā)表和多種分子標(biāo)記的應(yīng)用，使得葉色突變體分子調(diào)控機(jī)制的研究更加深入，同時(shí)葉色突變體的研究?jī)r(jià)值得到了越來(lái)越多的關(guān)注。本試驗(yàn)的研究結(jié)果將在一定程度上為今后開(kāi)展的該突變體的葉色突變機(jī)制、葉色基因的定位及克隆等相關(guān)研究工作奠定基礎(chǔ)。