王秀爽，田江麗，邵勝楠，崔志浩，潘崇樂(lè)，張國(guó)強(qiáng)

(1.石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003)

放線菌是一類極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的微生物，它不僅能夠產(chǎn)生多種抗生素[1]，還能代謝產(chǎn)生極具商用價(jià)值的多糖或蛋白質(zhì)類物質(zhì)[2]，其中不乏一些具有農(nóng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值的生物活性物質(zhì)。因此，放線菌資源的挖掘一直是各國(guó)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。植物病害嚴(yán)重威脅著中國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，以放線菌為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)微生物源農(nóng)藥既可在一定程度上挽回病害損失，還能降低對(duì)環(huán)境的污染。中國(guó)新疆地域廣闊，擁有多種特殊的自然環(huán)境，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源。因此，深入挖掘新疆微生物資源，開(kāi)發(fā)具有新疆特色的微生物源農(nóng)藥，對(duì)中國(guó)植保領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外多家科研單位對(duì)新疆放線菌資源開(kāi)展深入挖掘工作，主要對(duì)羅布泊、艾比湖、于田鹽池、哈密鹽湖等干旱或高鹽環(huán)境中的放線菌進(jìn)行研究[3-8]，發(fā)現(xiàn)大量放線菌新種，如Streptomycesluteus、Nocardiopsisakesuensis、Saccharothrixlopnurensis、Glycomycesxinjiangensis等[9-12]。然而，對(duì)于這些新疆特色放線菌的農(nóng)用活性研究相對(duì)較少，加之國(guó)內(nèi)外對(duì)新疆放線菌資源的挖掘主要集中在南疆的荒漠和鹽湖地區(qū)，對(duì)天山天池地區(qū)放線菌資源的農(nóng)用活性研究則更為稀少。因此，有必要開(kāi)展新疆天池放線菌資源挖掘及農(nóng)用活性研究。本研究對(duì)天池地區(qū)土壤樣品中的放線菌進(jìn)行選擇性分離，結(jié)合離體和活體試驗(yàn)篩選對(duì)植物病原菌具有抑制作用的放線菌，并進(jìn)行初步分類鑒定，以期獲得具有研究與開(kāi)發(fā)價(jià)值的資源放線菌，為開(kāi)發(fā)新疆特色微生物源農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品 采自新疆天池地區(qū)(海拔1 900 m 左右，88.12～88.15°N，43.85～43.92°E，采集時(shí)間為2016年12月)的12份土壤樣品，按照土壤類型混合為4種土樣，分別為砂土、壤土、草甸土以及河底泥土，陰干，備用。

1.1.2 分離及純化培養(yǎng)基 GA培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.05 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH為7.4～7.6。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH為7.4～7.6。

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH為7.4～7.6。

TPA培養(yǎng)基：海藻糖5 g，脯氨酸1 g，(NH4)2SO41 g，NaCl 1 g，CaCl22 g，K2HPO41 g，ZnSO4·7H2O 1 g，硫胺素50 μg，核黃素50 μg，煙酸50 μg，泛酸鈣50 μg，維生素B650 μg，肌醇50 μg，對(duì)-氨基苯甲酸50 μg，生物素25 μg，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH為7.2。

HVA培養(yǎng)基：腐殖酸1 g，CaCO30.02 g，Na2HPO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，KCl 1.7 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，硫胺素50 μg，核黃素50 μg，煙酸50 μg，泛酸鈣50 μg，維生素B650 μg，肌醇50 μg，對(duì)-氨基苯甲酸50 μg，生物素25 μg，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH為7.4。

CA培養(yǎng)基：幾丁質(zhì)4 g，K2HPO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 mg，瓊脂20 g，硫胺素50 μg，核黃素50 μg，煙酸50 μg，泛酸鈣50 μg，維生素B650 μg，肌醇50 μg，對(duì)-氨基苯甲酸50 μg，生物素25 μg，蒸餾水1 L，pH為7.4。

GB培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.05 g，蒸餾水1 L，pH為7.4～7.6。

1.1.3 抑制劑 放線菌酮和萘啶酸均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 供試病原菌 立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、番茄灰霉病原菌(Botrytiscinerea)，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.5 供試種子 黃瓜種子(‘荷蘭35’，感病品種)，由新疆建設(shè)兵團(tuán)第十師北屯市農(nóng)科所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土樣采集方法 在每個(gè)采樣地區(qū)選取多個(gè)采樣點(diǎn)，采用蛇形采樣法進(jìn)行取樣，土層深度為0～5 cm。取樣品200～500 g采用四分法進(jìn)行混合。將所采土樣裝入布袋或聚乙烯塑料袋，內(nèi)外均應(yīng)附標(biāo)簽，標(biāo)明采樣編號(hào)、名稱、采樣深度、采樣地點(diǎn)、日期、采集人等信息。

1.2.2 土樣中微生物含量測(cè)定方法 稱取0.5 g風(fēng)干土樣，用無(wú)菌水系列稀釋至10-4，取100 μL分別按照以下方式處理：細(xì)菌在28～30 ℃條件下用NA培養(yǎng)基恒溫培養(yǎng)，放線菌用GA培養(yǎng)基培養(yǎng)，真菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用平板計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)每克干土中細(xì)菌、放線菌和真菌的個(gè)數(shù)。

1.2.3 土壤放線菌分離方法 將供試土樣風(fēng)干磨碎過(guò)200目篩后，采用3種方法進(jìn)行處理：(1)稱取0.5 g風(fēng)干土樣，置于10 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)中30 ℃處理60 min，1 500 g離心20 min，然后靜置10 min，取上清液系列稀釋至10-4后取100 μL涂于分離培養(yǎng)基平板上分別于4 ℃和22 ℃培養(yǎng)15～30 d，挑出放線菌后于GA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。(2)稱取0.5 g風(fēng)干土樣，置于1.5%苯酚(5 mmol/L磷酸緩沖液pH=7.0配置)中30 ℃處理20 min 后取上清液系列稀釋至10-4，取100 μL涂于分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)15～30 d，挑出放線菌后于GA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。(3)稱取0.5 g風(fēng)干土樣，用無(wú)菌水懸浮后，系列稀釋至10-4，取100 μL涂于分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)15～30 d，挑出放線菌后于GA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。所有分離培養(yǎng)基內(nèi)均含有50 mg/L放線菌酮和50 mg/L萘啶酸。

1.2.4 放線菌發(fā)酵液制備 將放線菌接種于GA培養(yǎng)基平板上，27 ℃培養(yǎng)5～7 d，取8個(gè)6 cm菌餅接種至GB液體培養(yǎng)基(100 mL)中，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)5～7 d，取上清過(guò)0.45 μm 無(wú)菌濾膜后備用。

1.2.5 抑菌活性測(cè)定 對(duì)峙法：在培養(yǎng)皿上穿過(guò)中心作一條線，將放線菌接種于線上1/3處，28 ℃培養(yǎng)2～3 d至完全定殖后，將病原真菌菌塊接種至放線菌菌落對(duì)稱位置，繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d 后，測(cè)量放線菌菌落之間的真菌菌落寬度。

牛津杯法：在GA培養(yǎng)基平板表面直接對(duì)稱放置2個(gè)牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。在杯中加入200 μL發(fā)酵液無(wú)菌濾液，在2個(gè)牛津杯中間接種病原真菌，28 ℃培養(yǎng)3 d后測(cè)量抑菌圈直徑。

盆栽法：取籽粒飽滿的黃瓜種子在φ=75%乙醇中表面消毒3 min，用無(wú)菌水清洗3次，然后放于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置于30 ℃條件下催芽48 h。試驗(yàn)使用的土壤中含有立枯病菌1.5 g/kg。試驗(yàn)時(shí)將10粒黃瓜種子淺播于花盆中，并加入20mL放線菌菌株發(fā)酵液。設(shè)無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。每隔3 d加1次發(fā)酵液，培養(yǎng)9 d時(shí)檢查植株發(fā)病率、株高以及發(fā)芽率。

1.2.6 放線菌鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：采用插片法[13]在GA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)放線菌3～5 d后，在400倍電子顯微鏡下觀察菌絲及孢子絲形態(tài)，然后利用鑒定手冊(cè)進(jìn)行分類鑒定[14]。

放線菌菌株在GB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(全式金，中國(guó))進(jìn)行放線菌基因組DNA提取；使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG- ACTT5-3′)，結(jié)合EasyTaqPCR SuperMix(全式金，中國(guó))進(jìn)行16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次，72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳檢測(cè)， PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行純化與測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST，選取相似度較高的菌株序列，利用MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建(使用NJ法建樹(shù)，Bootstrap法進(jìn)行1 000次重復(fù)，利用Kimura 2-parameter法計(jì)算進(jìn)化距離)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncun’s新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 天池地區(qū)不同類型土壤中的微生物含量差異

新疆天池地區(qū)的4類土壤樣品中含有大量微生物，包括真菌、細(xì)菌和放線菌。從表1可看出，4種土壤樣品中細(xì)菌含量最高，其次為放線菌，真菌最少。其中草甸土中放線菌數(shù)量最多，為1.58×108CFU/g。而砂土中的放線菌數(shù)量最少，為2.67×107CFU/g。

表1 天池地區(qū)不同類型土壤微生物含量Table 1 Microbial content in differentsoil types of Tianchi

2.2 天池放線菌的分離與純化

采用2種預(yù)處理方法和3種分離培養(yǎng)基對(duì)供試的4類土壤樣品中放線菌進(jìn)行選擇性分離，共分離得到213株放線菌。從表2可以看出，草甸土樣品中分離得到的放線菌數(shù)量最多，壤土次之，兩者得到的放線菌數(shù)量分別為86株和79株，占放線菌分離總數(shù)的40.38%和37.09%。

表2 各土樣中放線菌的分離情況Table 2 Data of actino mycetei solation from soil samples

2.3 天池放線菌的抑菌活性

采用菌株對(duì)峙法測(cè)定213株放線菌對(duì)立枯絲核菌和番茄灰霉病菌的拮抗作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有14株放線菌對(duì)立枯絲核菌的拮抗效果在70%以上(表3)，8株放線菌對(duì)番茄灰霉病菌的拮抗效果在60%以上(表4)。其中有5株放線菌(TC-33、TC-50、TC-52、TC-95和TC-174)對(duì)立枯絲核菌和番茄灰霉病菌均具有抑制作用。

表3 14株放線菌對(duì)立枯絲核菌的抑制效果(對(duì)峙法)Table 3 Inhibition of 14 strains against R.solani(Antagonistic method)

注：數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note：Values followed by the different letters in the same column are significantly different(P<0.05).The same below.

表4 8株放線菌對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果(對(duì)峙法)Table 4 Inhibition of eight strains against B.cinerea(Antagonistic method)

利用牛津杯法對(duì)5株放線菌的菌株代謝物的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示該5株放線菌的代謝物對(duì)立枯絲核菌和番茄灰霉病菌均具有較強(qiáng)的抑制作用(表5)，說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)主要為胞外代謝產(chǎn)物。

利用盆栽法測(cè)定5株放線菌對(duì)黃瓜立枯病的防治效果，結(jié)果顯示放線菌TC-33、TC-50和TC-95的菌株代謝物對(duì)黃瓜立枯病均具有較好的防治效果(圖1-A)，其中TC-50菌株代謝物的防效最高，為89.98%。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TC-50發(fā)酵液可促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)(圖1-B)，而TC-95發(fā)酵液對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。3株放線菌的代謝物均可提高黃瓜種子在含菌土壤中的發(fā)芽率，尤其是TC-50，其菌株發(fā)酵液可使種子發(fā)芽率提高90%以上(圖1-C)。

表5 5株放線菌發(fā)酵液對(duì)2種病原菌的 抑制作用(牛津杯法)Table 5 Inhibition of five strain’s metabolites against two pathogenic fungi (Oxford-cup method)

2.4 放線菌TC-50初步鑒定

經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，放線菌TC-50菌落為灰白色、干燥、絨狀、無(wú)色素產(chǎn)生(圖2-A)，氣生菌絲豐富，孢子絲為直線形，孢子呈橢圓形(圖2-B)，屬于灰白色放線菌類群；利用分子手段對(duì)放線菌TC-50進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示TC-50與StreptomyceschumphonensisKK1-2(NR_126175)親緣關(guān)系最近(84%)，其序列相似達(dá)98%(圖3)，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析，最終確定放線菌TC-50歸屬于鏈霉菌(Streptomycessp.)。

A.菌株代謝物對(duì)黃瓜立枯病的防治效果 Effects of strain’s metabolites againstRhizoctoniarot；B.菌株代謝物對(duì)黃瓜幼苗株高的影響 Effects of strain’s metabolites on plant height of cucumber；C.菌株代謝物對(duì)黃瓜種子發(fā)芽及生長(zhǎng)的影響 Effects of strain’s metabolites on germination and growth of cucumber seeds；D.對(duì)照 Control

圖13株放線菌菌株代謝物對(duì)黃瓜立枯病的防治效果及對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響
Fig.1Effectsofthreestrain’smetabolitesonRhizoctoniarotandseedlinggrowthofcucumber

圖2 放線菌TC-50菌落(A)及孢子絲形態(tài)(B)Fig.2 Colony (A) and sporotrichial (B) of strain TC-50

圖3 基于16S rDNA序列分析的放線菌TC-50系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain TC-50 based on the sequence analysis of 16S rDNA

3 討 論

新疆地域廣闊，擁有多種特殊的自然環(huán)境，造就了該地區(qū)獨(dú)特的微生物資源及其特殊的代謝物。天山天池位于新疆塔里木盆地和準(zhǔn)噶爾盆地天然分界線上，海拔1 928 m，年均氣溫2.5 ℃，冬季長(zhǎng)期處于-15 ℃以下。本研究從該地區(qū)獲得213株放線菌，其中有24株耐4 ℃低溫的放線菌?？梢?jiàn)，該地區(qū)的耐低溫放線菌較為豐富。另外，本研究發(fā)現(xiàn)草甸土中的放線菌數(shù)量(1.58×108CFU/g)顯著高于其他類型土壤中的放線菌。從王啟蘭等[15]的研究可見(jiàn)，青藏高原地區(qū)多種草甸土中平均放線菌數(shù)量顯著低于本研究結(jié)果，僅為5.676×104CFU/g，但是獲得的低溫放線菌數(shù)量占比較高，為32.35%，其原因可能是青藏高原地區(qū)海拔較高，氣溫較低，更適合低溫放線菌的生長(zhǎng)。

本研究以立枯絲核菌和番茄灰霉病菌為指示菌株，對(duì)213株放線菌進(jìn)行抑菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)17株放線菌具有一定抑菌活性，占比8.0%。筆者曾對(duì)青藏高原地區(qū)放線菌進(jìn)行抑菌活性篩選，在279株放線菌中發(fā)現(xiàn)28株具有抑菌活性的放線菌(組織法活性測(cè)定結(jié)果大于60%)，占比10%[16]，這與本研究結(jié)果有一定差異，主要原因在于土樣來(lái)源的不同、供試病原菌差異及生物活性測(cè)定方法的不同。因此，對(duì)于天池放線菌的生物活性需要深入研究，可針對(duì)抑菌、殺蟲(chóng)、除草、誘抗活性等方面進(jìn)行廣泛篩選。

分子鑒定結(jié)果顯示，菌株TC-50與S.chumphonensis最近緣。S.chumphonensis最早是在海洋沉積物中分離得到的，它的氣生菌絲為白色至黃白色，能產(chǎn)生長(zhǎng)鏈狀的非移動(dòng)性孢子[17]，而且至今仍未有文獻(xiàn)報(bào)道該菌株具有抑菌活性，由此可見(jiàn)菌株TC-50與S.chumphonensis存在較大差異。后期將采用細(xì)胞壁成分分析、DNA雜交等技術(shù)進(jìn)一步探究?jī)烧咧g的關(guān)系，并明確菌株TC-50的準(zhǔn)確分類地位。