林凡 張?jiān)?黃慧珍 高冬

（1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 福建 福州 350122）

（2 福建教育學(xué)院 福建 福州 350000）

血管新生（angiogenesis）是在已有血管基礎(chǔ)上通過(guò)動(dòng)員誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs），隨后ECs增殖、遷移、黏附等過(guò)程生成新血管的過(guò)程。在血管異常增生性疾?。ㄈ缣悄虿?、腫瘤）和缺血性疾病（如心肌梗死、腦梗死、冠心?。┌l(fā)生、發(fā)展和治療中，調(diào)節(jié)疾病相關(guān)的血管新生是研究熱點(diǎn)之一[1]。血府逐瘀湯為活血化瘀經(jīng)典方，血府逐瘀膠囊為該方劑常用中成藥，在臨床上可用于冠心病、糖尿病等血管新生相關(guān)疾病的治療。研究顯示，其可適度促進(jìn)ECs的血管新生[2]。微小RNA（microRNA,miR）是體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的一類(lèi)重要分子。研究表明，ECs中表達(dá)的miR378參與血管新生的調(diào)節(jié)[3]。血府逐瘀膠囊是否影響ECs 中miR378表達(dá)，后者在血管新生過(guò)程中如何作用？這些問(wèn)題尚不明確。

本研究以人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC-1）為材料，分析血府逐瘀膠囊對(duì)hsa-miR-378a-5p表達(dá)的影響，采用生物信息學(xué)方法分析該miR成熟體在血管新生過(guò)程中的可能機(jī)制，以期為深入研究血府逐瘀湯調(diào)控血管新生機(jī)制提供理論參考。

1.材料與方法

1.1 細(xì)胞株及含藥血清

HMEC-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；含藥血清的制備參照文獻(xiàn)3所述，血府逐瘀膠囊由天津宏仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，主要成分為當(dāng)歸、生地黃、炒桃仁、紅花、麩炒枳殼、赤芍、柴胡、甘草、桔梗、川芎和牛膝。

1.2 試劑及設(shè)備

MCDB-131培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibio公司，miRNeasy Mini Kit（217004）購(gòu)自Qiagen公司，miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR201）、miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒（FP401）、hsa-miR-378a-5p檢測(cè)引物（CD201-0584）和內(nèi)參U6（CD201-0145）引物購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；CO2培養(yǎng)箱為德國(guó)Heraeus公司生產(chǎn)，熒光定量PCR儀（CFX96 Touch）產(chǎn)自美國(guó)Biored公司。

1.3 Q-PCR分析血府逐瘀膠囊對(duì)HMEC-1細(xì)胞hsa-miR-378a-5p表達(dá)的影響

HMEC-1細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)同步化處理后隨機(jī)分為處理組與對(duì)照組。處理組加2.5%含藥血清處理，以2.5%空白血清處理為對(duì)照。給藥處理48 h后，收集細(xì)胞并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)所述方法提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；采用95℃ 15min, 94℃20s，60℃ 35s，40個(gè)循環(huán)，以U6為內(nèi)參進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)。

1.4 生物信息學(xué)分析

綜合運(yùn)用miRanda、miRDB、Pictar2和Targetscan等常用數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)hsa-miR-378a-5p靶基因，取交集作為后繼分析的基因集合。從OMIM（https∶//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到血管新生相關(guān)基因，并從HPRD（http∶//www.hprd.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取人類(lèi)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)作為背景網(wǎng)絡(luò)。隨后用Cytoscape 3.2.1軟件分別以預(yù)測(cè)的靶基因和血管新生相關(guān)基因構(gòu)建“hsa-miR-378a-5p靶點(diǎn)-人類(lèi)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)”、“血管新生相關(guān)基因-人類(lèi)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)”蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析各節(jié)點(diǎn)的度值和兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)的重合度。最后利用David數(shù)據(jù)庫(kù)（https∶//david.ncifcrf.gov/）對(duì)在兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)中重合基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)╣ene ontology analysis，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG）生物通路數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為界值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0進(jìn)行分析，采用2-△△ct法分析目的基因的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 血府逐瘀膠囊促進(jìn)HMEC-1細(xì)胞hsa-miR-378a-5p的表達(dá)

與2.5%空白血清對(duì)照組相比，2.5%含藥血清處理細(xì)胞48h可以顯著提高h(yuǎn)sa-miR-378a-5p的表達(dá)水平（圖1）。

圖1 血府逐瘀膠囊對(duì)HMEC-1細(xì)胞hsa-miR-378a-5p 表達(dá)的影響

2.2 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

利用4個(gè)miR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，分別得到7154、791、247和12942個(gè)靶基因，取4個(gè)庫(kù)共同預(yù)測(cè)的11個(gè)為候選靶基因（表1）。

表1 hsa-miR-378a-5p靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3 預(yù)測(cè)靶基因的生物信息學(xué)分析

將11個(gè)候選靶基因構(gòu)建“hsa-miR-378a-5p靶點(diǎn)-人類(lèi)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)”蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)包括250個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中度值最高節(jié)點(diǎn)為預(yù)測(cè)靶基因ATXN1（度值154），其次為G蛋白αq亞基（GNAQ，度值40）和環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB1，度值38）。

圖2 “hsa-miR-378a-5p靶點(diǎn)-人類(lèi)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)

為分析這些蛋白與血管新生關(guān)系，獲取血管新生相關(guān)基因并構(gòu)建“血管新生相關(guān)基因-人類(lèi)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)比2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果二者這間存在50個(gè)重復(fù)節(jié)點(diǎn)，占hsamiR-378a-5p靶點(diǎn)互作蛋白總數(shù)的25%，提示該miR可能通過(guò)這50個(gè)蛋白調(diào)節(jié)ECs細(xì)胞的血管新生。50個(gè)重復(fù)節(jié)點(diǎn)中包括GNAQ和CREB1兩個(gè)高度值的靶基因，提示它們可能是該miR調(diào)節(jié)血管新生的關(guān)鍵靶點(diǎn)。利用DAVID平臺(tái)對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果篩選出35個(gè)條目（P＜0.05），可聚集成7類(lèi)。其中涉及生物過(guò)程有18條，包括蛋白磷酸化、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)錄等；涉及分子功能有13條，包括蛋白激酶活性、ATP結(jié)合、RNA轉(zhuǎn)錄起始、泛素蛋白連接酶結(jié)合等；涉及細(xì)胞組成有4條，涉及核染色質(zhì)、質(zhì)膜、膜筏、黏著斑等（表2）。進(jìn)行KEGG通路注釋分析，篩選出顯著54條通路（P＜0.05），其中包括VEGF信號(hào)、黏附斑、細(xì)胞周期、PI3K-Akt、ErbB信號(hào)、mTOR信號(hào)等血管新生信號(hào)途徑（表3）。

表2 血管新生相關(guān)hsa-miR-378a-5p靶蛋白互作蛋白的GO條目示例

表3 與血管新生相關(guān)的KEGG經(jīng)典生物通路示例

3.討論

miR在廣泛參與血管新生的各種過(guò)程。一些研究表明，miR-378可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞遷移，侵襲和血管新生在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中起重要作用，如非小細(xì)胞肺癌[5]、卵巢癌[6]。血府逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，為活血化瘀的代表方之一。多項(xiàng)研究表明血府逐瘀湯可適度調(diào)節(jié)血管新生，具有多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)。本研究在前期miR測(cè)序基礎(chǔ)上，通過(guò)Q-PCR方法證明血府逐瘀湯可促進(jìn)HMEC-1中hsa-miR-378a-5p的表達(dá)，提示其可能參與了血府逐瘀湯調(diào)節(jié)ECs血管新生的過(guò)程。

miR大多具有復(fù)雜的調(diào)控功能，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析，為后繼實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供有力的資料是常用策略。hsa-miR-378a-5p靶基因預(yù)測(cè)篩選出11個(gè)候選基因，PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明GNAQ和CREB1兩個(gè)靶基因與人體較多蛋白質(zhì)具有互作關(guān)系。其中GNAQ編碼Gα（q）亞基,是G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)途徑的中心結(jié)構(gòu)，參與多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，其突變可導(dǎo)致先天性血管瘤發(fā)生[7]。CREB1參與氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管，可能調(diào)節(jié)PI3K/Akt及VEGF-A信號(hào)[8]。GO和KEGG通路分析結(jié)果提示，hsa-miR-378a-5p可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白磷酸化水平，通過(guò)影響VEGF信號(hào)、黏附斑、PI3KAkt、ErbB信號(hào)等血管新生信號(hào)途徑參與血管新生的調(diào)節(jié)。其中VEGF參與血管新生全過(guò)程，聯(lián)系PI3K-Akt、mTOR等信號(hào)通路，作用關(guān)鍵。前期研究亦表明血府逐瘀湯可調(diào)節(jié)ECs中VEGF的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管新生[3]。

綜上所述，血府逐瘀湯調(diào)節(jié)HMEC-1細(xì)胞中hsa-miR-378a-5p表達(dá)；該miR可能作用于GNAQ、CREB1等基因，通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF等信號(hào)途徑參與這一過(guò)程。