周愷驊，高基民

(溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

據世界衛(wèi)生組織癌癥研究中心(IARC)報告，肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。美國癌癥協(xié)會(American Cancer Society)統(tǒng)計，2017年全美新增的609 640例癌癥死亡病例中，肺癌分別以26%和25%占據男、女癌癥死亡病例的首位[1-2]。為了深入地研究肺癌，動物模型是所有研究的基礎?，F有的肺癌模型主要分為2種，一種是通過誘導上皮轉化來實現，利用化學致癌物或基因工程改變致癌基因或抑癌基因的表達[3]，另一種是利用肺癌細胞株或患者腫瘤細胞進行異位或正位遞送。前者易于肺癌遺傳學上的研究及靶向藥物的研發(fā)，但是成瘤時間較長、建模系統(tǒng)相對復雜及成本較高等問題限制了其應用。目前應用較多的是利用癌細胞株進行皮下異位移植，但也有學者比較了小鼠正位肺癌模型和皮下模型，認為正位模型雖然操作復雜，但其轉移率和腫瘤生物學特征更符合臨床實際情況[4]。已有研究利用Lewis細胞株建立小鼠正位肺癌模型[5-7]，這些研究較多地選擇了開放性的方式，對小鼠胸部皮膚切開后進行肺部正位注射來構建肺癌模型。這種方式對操作者的要求較高，耗時較多，難以滿足量大的動物實驗研究。本文基于前者的研究，探索了一種非開放性的建模方式，利用穩(wěn)定表達熒光素酶的小鼠Lewis肺癌細胞系進行肺癌正位模型的建立。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

Lewis肺癌(lewis lung carcinoma，LLC)細胞株屬鼠源性的非小細胞肺癌細胞株，購自中國科學院。

1.1.2 試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、嘌呤霉素(Gibco，美國)，青霉素-鏈霉素溶液(碧云天，中國)，Matrigel基質膠(BD，美國)。

1.1.3 實驗動物

C57BL/6小鼠購自上海斯萊克動物中心，雄性，5～6周齡，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學SPF級實驗室，獨立送風柜中飼養(yǎng)，自由飲水和進食。

1.2 方法

1.2.1 構建表達熒光素酶的LLC穩(wěn)轉細胞株

構建plvx-EF1α-luc2-gfp-puro載體質粒包裝慢病毒，轉導LLC細胞，使其在表達熒光素酶的同時又具有嘌呤霉素抗性及綠色熒光蛋白(GFP)雙篩選標記。1)慢病毒轉導。取生長狀態(tài)良好的LLC細胞，進行細胞計數。取2×105個細胞培養(yǎng)24 h，更換為不含抗生素的培養(yǎng)基，加入載體質粒plvx-EF1α-luc2-gfp-puro包裝的慢病毒，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。2)嘌呤霉素篩選。對感染后的細胞進行換液，培養(yǎng)24 h后更換為含有2 μg·mL-1嘌呤霉素的培養(yǎng)基，同時以未經過感染的LLC細胞作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。3)流式細胞術分選GFP陽性的LLC細胞。對經過嘌呤霉素篩選的細胞進行流式分選，篩選出單個GFP陽性細胞，繼續(xù)培養(yǎng)于20% FBS的培養(yǎng)基，第5天在熒光顯微鏡下標記出生長狀態(tài)較好的單克隆群，進行擴大培養(yǎng)，對細胞株鑒定后凍存保種。

1.2.2 小鼠正位肺癌模型的構建

將含有表達熒光素酶的LCC細胞(5×104個)細胞懸液與Matrigel基質膠等體積混勻，抽吸入事先預冷好的胰島素注射器。使用異氟烷將小鼠麻醉，待小鼠呼吸平穩(wěn)，呼吸頻率降低后，捏緊小鼠胸部皮膚使其暴露整個胸部輪廓，對其皮膚進行消毒，在小鼠左側肋弓下緣1～1.5 cm與左鎖骨中線交叉處注射，進針深度3～5 mm，角度以垂直為佳，注射細胞懸液25 μL，注射完后停頓5～10 s。

1.2.3 小鼠活體成像操作

小鼠于腫瘤細胞注入后第6、16、26、36和46天進行活體成像。首先給予小鼠腹腔注射蟲螢光素酶底物，濃度為15 mg·mL-1，劑量為150 mg·kg-1，底物作用3 min后，予以異氟烷吸入麻醉，然后再放入主機箱內，共曝光10 min，每隔30 s進行圖像拍攝。

2 結果與分析

2.1 穩(wěn)定表達熒光素酶的LLC細胞株的建立

通過基因工程改造的細胞株往往不及野生型穩(wěn)定，而異種移植入小鼠體內后熒光素酶基因容易丟失，熒光值的大小無法準確地代表活體小鼠內腫瘤的大小。為得到表達更穩(wěn)定的細胞株，本研究自主構建載體質粒plvx-EF1α-luc2-gfp-puro包裝慢病毒，成功轉導LLC細胞后，可使其在表達熒光素酶的同時又具備嘌呤霉素抗性和GFP這2個雙篩選標記。LLC細胞在病毒感染24 h后用嘌呤霉素進行首輪篩選，此時GFP陽性的細胞約為90%；再用流式細胞術進行第2輪篩選，分選出單個GFP陽性細胞。在分選后第5天和第10天觀察細胞生長狀態(tài)，其中有10個單克隆群細胞活力較好(圖1)。對分選出的單克隆群進行擴大培養(yǎng)后，用流式細胞術對活細胞中GFP的陽性率進行檢測，陽性率均可達到95%以上(圖2)。

圖1 LCC細胞的生長形態(tài)

圖2 LLC活細胞中GFP的陽性率(%)

A,細胞活體成像；B,熒光顯微鏡觀察；C，Western blot檢測LLC穩(wěn)轉細胞中GFP和luciferase蛋白水平的表達情況圖3 表達熒光素酶的LLC穩(wěn)轉細胞株的鑒定

取活力較好的1株進行動物建模，利用細胞活體成像、熒光顯微鏡以及Western blot對細胞進行鑒定(圖3)。結果表明，穩(wěn)定表達熒光素酶的LLC細胞株構建成功。

2.2 小鼠正位肺癌模型的建立

利用LLC穩(wěn)轉細胞株，以C57BL/6小鼠構建正位肺癌模型。整個實驗的觀察周期為60 d，期間每隔1天記錄小鼠體重，觀察小鼠精神狀態(tài)、行動力。取部分小鼠每10 d進行1次活體成像，記錄腫瘤變化情況。在腫瘤注入后的第4周，小鼠陸續(xù)出現體重大幅下降、毛色變差、行動力減弱等惡病質變，小鼠呼吸頻率加快、弓背狀呼吸等腫瘤浸潤肺部的體征十分明顯，個別小鼠甚至出現腫瘤侵襲脊髓后偏癱的現象(圖4)。小鼠解剖后，可見肺部腫瘤的形成，部分肺葉有出血性病變，小鼠脾臟出現出血性壞死。

取病變肺葉進行HE染色后發(fā)現，正常的肺泡結構已經消失，可見大量增殖的異型性腫瘤細胞，腫瘤細胞大小形狀不一、排列不規(guī)則、細胞分化差、核大深染、核質比增大、分裂相多見(圖5)。

活體成像結果如圖6所示。隨著腫瘤變大，光子量不斷增加，在最后一次成像中由于光子量過強而導致無法成像。小鼠的體重變化和生存率如圖7所示，與活體成像結果相符合。

3 討論

小鼠肺癌模型包括了自發(fā)性腫瘤模型和移植性腫瘤模型。自發(fā)性腫瘤模型可通過化學致癌物或基因工程來實現，這類模型由于成瘤時間較長、建模系統(tǒng)相對復雜，以及成本較高等問題限制了其應用[8]。移植性腫瘤模型因成瘤率穩(wěn)定、所需成瘤時間較短等特點，在實際科研中更為常用。移植性小鼠肺癌模型主要分為正位移植模型及異位移植模型，正位移植又包括了支氣管內注射和肺內注射2種方法。Sato等[9]使用氣管內注射構建正位移植模型，但該方法操作復雜、成瘤及瘤體大小、數目均不穩(wěn)定。因此，腫瘤的正位移植動物模型是目前較為理想可靠的腫瘤模型。

A，腫瘤侵襲小鼠肺組織和脊髓受腫瘤浸潤后的表現；B,小鼠肺部和脾臟大體病變圖4 C57BL/6小鼠正位肺癌模型構建

圖5 小鼠肺組織的病理學觀察

圖6 小鼠活體的成像情況

圖7 小鼠存活率和平均體重

Lewis細胞株被廣泛應用于肺癌正位模型的建立，最初由Bertram等在C57BL/6小鼠身上獲取，其成瘤性強，在小鼠體內轉移性較弱[10]。由于該細胞株具有較強的成瘤性，有學者對其建模所需的細胞量進行了探討。Liu等[11]用接種細胞總數104、105和106進行造模，成瘤率分別為83.3%、100%和100%。低劑量組由于接種時細胞有滲漏，導致細胞數未達104而有部分小鼠造模不成功，高劑量組在第3天即可長出腫瘤，第9天全部小鼠成瘤。高劑量組所面臨的問題是大量細胞可以誘導快速和廣泛的炎癥反應，并且這些細胞可以壓倒并逃避針對原發(fā)性腫瘤的正常免疫應答，所以大劑量的細胞可能并不適合后期的實驗需求。Weiss等[7]在構造早期肺癌模型中僅以1 000個細胞就達到了100%的成瘤率。綜合以上研究，本研究以5×104作為注射量，注射后小鼠在第6天可以檢測到腫瘤，第16天成像時成瘤率可達100%，第5周開始出現惡病質，中位生存期為46 d。

本研究中所用到的活體生物熒光成像技術是近年來發(fā)展起來的一項分子、基因表達的分析檢測系統(tǒng)，主要由敏感的CCD設備及其分析軟件和作為報告子的熒光素酶以及熒光素組成。該技術是在小型哺乳動物體內利用報告基因-熒光素酶基因表達所產生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗 ATP 發(fā)生氧化反應，將部分化學能轉變?yōu)榭梢姽饽茚尫?，然后在體外利用敏感的 CCD 設備形成圖像。該方法具有很好的靈敏度，可以準確的檢測到腫瘤的大小，同時也要求LLC細胞系可以穩(wěn)定的表達熒光素酶。在篩選細胞時，本研究設計了GFP和嘌呤霉素抗性2個篩選標記，經過2輪篩選從而獲得表達更穩(wěn)定的細胞系。也有學者利用GFP進行成像，建立穩(wěn)定表達GFP的LLC細胞，對C57BL/6進行肺部注射，用熒光護目鏡和激光二極管泵浦(LDP)470 nm的藍光手電筒觀察成瘤情況[12-13]。應用IVIS成像系統(tǒng)，在小鼠皮下最少可以檢測到經生物發(fā)光標記的3個T細胞[14]。與利用激發(fā)光與反射光的熒光成像相比，酶和底物的特異性要遠遠超過熒光物質發(fā)光的特異性，可以形成極高的信噪比，所以生物發(fā)光的靈敏度要高出熒光的靈敏度大約一萬倍，并且有更高的特異性。

在以往的研究中，利用LLC細胞系建立小鼠正位肺癌模型往往以開放性手術的方式對小鼠進行胸部皮膚切開，該方法可以準確地找到肺葉所在位置，防止細胞外漏于胸腔。在前期實驗中，本研究嘗試用該方法進行造模。該方法要求操作者手法嫻熟，但也有部分小鼠因為皮膚切開后體溫降低，導致后期麻醉蘇醒時間過長而死亡，并且由于操作過程復雜、時間過長，無法滿足后期大規(guī)模動物實驗的要求。本研究探索了非開創(chuàng)性的造模方式，成功建立了小鼠正位肺癌模型，節(jié)約了造模時間，對大規(guī)模的肺癌動物研究具有重要意義。