白 婧，肖會(huì)敏，何 悅，雷美娜，張明科，王四旺

1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710077；2空軍軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所；3西安樂(lè)健生物科技有限公司

沙菊茶(商品名為王儲(chǔ)三高沙菊代用茶)由葛根、菊花、西紅花等6味藥食同源中藥組成。該處方是陜西西安樂(lè)健生物科技有限公司生產(chǎn)的袋泡茶，主要用于防治“三高”即高血脂、高血糖、高血壓疾病?！叭摺笔菍?dǎo)致心腦血管疾病的主要因素，而心腦血管疾病是影響人類(lèi)死亡的主要原因［1］。沙菊茶中葛根含有葛根素等能治療糖尿病、高血壓等?。?-9］；桑椹有降血糖和血脂等作用［10］；枸杞子含有黃酮類(lèi)、多糖等成分，具有降糖、降脂等功效［11-12］；沙棘在循環(huán)、免疫、神經(jīng)等系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［13］；菊花含有綠原酸等，有抗糖尿病、保護(hù)心腦血管及肝臟等功效［14］；西紅花含有西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ等成分，能治療高脂血癥、糖尿病、高血壓等［15-17］。沙菊茶原料藥材經(jīng)粉碎、混勻等工藝制成袋泡茶。為研究茶劑中水溶性成分，本研究采用HPLC法并依據(jù)文獻(xiàn)［18］建立指紋圖譜；同時(shí)在不同泡茶時(shí)間對(duì)茶中綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ7個(gè)成分的溶出度進(jìn)行研究，以指導(dǎo)患者正確使用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Prominence UFLC，LC/Labsoluion色譜工作站，日本島津公司)；CPA225D型十萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)塞多利斯公司)；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山超聲儀器有限公司)。乙腈、甲醇(HPLC級(jí)，美國(guó)Honeywell公司)；超純水自制(美國(guó)Millipore純水儀制備)。

1.2 試藥 綠原酸(批號(hào)：110753-201415，含量96.2%)；表兒茶素(批號(hào)：110878-200102，含量 98.1%)、葛根素(批號(hào)：110752-201615，含量 95.4%)、木犀草苷(批號(hào)：111720-201609，含量 94.9%)、木犀草素(批號(hào)：111520-201605，含量 99.6%)、西紅花苷Ⅰ(批號(hào)：111588-201303，含量 92.6%)及西紅花苷Ⅱ(批號(hào)：111589-201304，含量92.4%)等對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；沙菊茶批號(hào)分別為：20160906(S1)，20160907(S2)，20160908(S3)，20160909(S4)，20160910(S5)，20160911(S6)，20160912(S7)，20160913(S8)，20160914(S9)，20160915(S10)，由陜西西安樂(lè)健生物科技有限公司提供。

2 指紋圖譜測(cè)定方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.085%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫：0～30 分鐘，B 95%→85%；30～45分鐘，B 85%→75%；45～55 分鐘，B 75%→70%；55～75 分鐘，B 70%→40%；75～110 分鐘，B 40%。記錄時(shí)間為 110分鐘。流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取葛根素對(duì)照品5.00 mg，置于50 mL量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液，作為參比物溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品3袋，混勻，稱(chēng)取4.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，加100 mL溫水，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30分鐘，再稱(chēng)定重量，加溫水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)：20160906)，連續(xù)進(jìn)樣5次，分別對(duì)40個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行分析，結(jié)果其相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD值分別小于2.0%和3.0%，表明該方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)：20160906)，分別于 0、2、4、8、12 和 24 小時(shí)進(jìn)樣，考察 40 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果其相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD值分別小于2.0%、3.0%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取5份供試品(批號(hào)20160906)，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備與“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，分別對(duì)40個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行分析，結(jié)果其相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積RSD值分別小于2.0%和3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 指紋圖譜建立及相似度分析 取10批沙菊茶樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備與“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣量20 μL，記錄指紋圖譜，峰20為葛根素即參比物，建立指紋圖譜。結(jié)果其共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD值均分別小于2.0%、3.0%，與指紋圖譜研究技術(shù)的要求相符。運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A)對(duì)10批沙菊茶的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果對(duì)選定的40個(gè)共有色譜峰進(jìn)行譜峰匹配，得出樣品指紋圖譜的共有模式；整體相似度為0.952～0.993；表明這10批沙菊茶的化學(xué)成分一致性較好，見(jiàn)圖1—2。

圖1 沙菊茶HPLC指紋圖譜

圖2 10批沙菊茶的HPLC圖譜

3 含量與溶出度測(cè)定方法與結(jié)果

3.1 色譜條件 檢測(cè)西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ波長(zhǎng)為 440 nm，余同“2.1”項(xiàng)。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取木犀草苷4.74 mg、木犀草素11.55 mg、西紅花苷Ⅰ12.96 mg和西紅花苷Ⅱ8.66 mg置50 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品溶液為A溶液；另取綠原酸8.32 mg、表兒茶素8.56 mg、葛根素6.29 mg置20 mL量瓶中，加A溶液至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液為B溶液，綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌窛舛确謩e為400.19、419.87、300.03、89.97、230.08、240.02、160.04 μg/mL 作為儲(chǔ)備液。

3.3 供試品溶液的制備 同“2.3”項(xiàng)。

3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 依據(jù)處方，分別制備缺桑椹和菊花藥材的制劑、缺西紅花藥材的制劑、缺葛根藥材的制劑，再依據(jù)“2.3”項(xiàng)分別制備桑椹和菊花藥、葛根、西紅花陰性對(duì)照溶液。

3.5 線(xiàn)性關(guān)系 精密量取儲(chǔ)備液0.01、0.02、0.10、0.20、0.50和 1.00 mL分別置于 1 mL 量瓶中并加70%甲醇稀釋至刻度，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣。以各對(duì)照品的質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積值(y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算得線(xiàn)性方程與相關(guān)系數(shù)(r)，結(jié)果表明各對(duì)照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照品線(xiàn)性方程及其濃度范圍

3.6 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)：20160906)，3種陰性對(duì)照溶液即缺桑椹和菊花藥、缺葛根、缺西紅花及綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果7種成分陰性對(duì)照均無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

圖3 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)HPLC圖譜

3.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)：20160906)，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別為1.02%、1.01%、1.07%、0.82%、0.91%、0.84%、1.08%，表明儀器精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號(hào)：20160906)，分別在第 0、2、4、8、12 和 24 小時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD(%)值分別為 0.72%、0.64%、0.79%、0.82%、0.95%、0.91%、0.75%，表明樣品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取5份樣品(批號(hào)：20160906)，分別按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)得綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ平均含量分別為0.1709、0.3716、0.8707、0.0285、0.5300、0.5607、0.1287 mg/g，RSD值分別為 1.41%、1.24%、1.09%、1.82%、1.25%、0.99%、1.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取沙菊茶(批號(hào)：20160906，其中綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ分別為0.1709、0.3716、0.8707、0.0285、0.5300、0.5607、0.1287 mg/g)4.5 g，分別添加混合對(duì)照品溶液(精密稱(chēng)取綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ適量，制成每1 mL 70%甲醇中含量分別為 0.0770、0.1700、0.3900、0.1300、0.2400、0.2500、0.0580 mg 的溶液)8.00 mL或10.00mL或12.00mL，再加水至刻度，按照“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共制備6份樣品，按照“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，表明該方法回收率良好，見(jiàn)附表1。

3.11 含量測(cè)定 精密量取10批樣品，分別按照“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品，按照“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各批樣品中綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的平均含量(mg/g)與RSD，結(jié)果平均含量分別為0.1717、0.3726、0.8735、0.0282、0.5314、0.5652 和0.1275 mg/g；RSD 分別為 1.44%、0.83%、0.760%、1.07%、0.81%、0.91%和 1.88%。

3.12 不同泡茶時(shí)間7個(gè)成分的溶出度測(cè)定 測(cè)定方法依據(jù)“3.3”項(xiàng)下方法與文獻(xiàn)［19］：取一袋供試樣品并精密稱(chēng)定，加入開(kāi)水100 mL浸泡，分別浸泡 5、10、15、30、40、50、60、90、120 分鐘取樣，并按照“3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)線(xiàn)性方程計(jì)算出水提液中綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量(mg/g)，見(jiàn)表 2。

表2 7個(gè)成分溶出度測(cè)定結(jié)果(n=3) mg/g

4 討論

根據(jù)樣品三維色譜圖及對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)下色譜信息的多少，采用二極管陳列檢測(cè)器對(duì)多批沙菊茶樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)檢測(cè)，結(jié)果270 nm時(shí)色譜峰較多，故將其作為沙菊茶水溶性成分HPLC指紋圖譜的定性波長(zhǎng)，同時(shí)綠原酸、表兒茶素、葛根素、木犀草苷、木犀草素等5個(gè)化合物與相鄰各峰有較好的分離度且陰性對(duì)照無(wú)干擾，所以也作為5個(gè)化合物的定量波長(zhǎng)；而西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ在440 nm處有最大吸收，分離度好、陰性對(duì)照無(wú)干擾，將其作為定量波長(zhǎng)。由于成分復(fù)雜所以采用梯度洗脫的方法。對(duì)有機(jī)相為乙腈、甲醇，水相為超純水、不同濃度的磷酸(0.085%、0.17%、0.34%、0.68%)進(jìn)行組合比較，結(jié)果乙腈-0.08與5%磷酸水溶液組合較為理想。本制劑為袋泡茶，故主要分析水溶性成分，所以使用水作為溶劑，采用不同時(shí)間(10、15、20、30、40、50、60 分鐘)溫水浸泡、超聲處理方法或加熱回流，結(jié)果超聲處理30分鐘較理想。對(duì)不同流速 (0.8、1.0、1.2mL/min) 與柱溫(30、35、40、45℃)進(jìn)行比較，柱溫超過(guò)或低于40℃大部分色譜峰分離度小或不能分開(kāi)；流速高于或低于1.0 mL/min大部分色譜峰分離度差；色譜記錄時(shí)間在110分鐘之后，無(wú)明顯色譜峰出現(xiàn)。因此，選擇柱溫40℃，流速1.0 mL/min和記錄時(shí)間為110分鐘。

在指紋圖譜研究中，在1號(hào)峰與2號(hào)峰之間檢測(cè)出沒(méi)食子酸；在36號(hào)峰與37號(hào)峰之間檢測(cè)出香草酸，均為桑椹中所含［20］。由于分離度差或含量較低，所以?xún)蓚€(gè)成分未定量。在定量研究中，桑椹含有表兒茶素和綠原酸［12］，菊花中含有綠原酸、木犀草苷、木犀草素［21-22］，因此定量制備陰性對(duì)照溶液時(shí)均須去除；葛根素是葛根的主要成分［3］，制備陰性對(duì)照溶液時(shí)去除葛根藥材；西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ是西紅花的主要成分［15-16］，制備陰性對(duì)照溶液時(shí)去除西紅花藥材；而指紋峰中 5、9、11、13、17、18、19、31、36、38 號(hào)等高峰值的峰為何種成分尚待進(jìn)一步研究。

在溶出度研究中，7種成分達(dá)到峰值的時(shí)間不一，但在60分鐘后大部分達(dá)到峰值。綠原酸在30分鐘達(dá)到峰值，表兒茶素、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ在40分鐘達(dá)到峰值，葛根素、木犀草苷、木犀草素在60分鐘達(dá)到峰值，這可能與各成分的溶解性及藥材質(zhì)地有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明建立HPLC指紋圖譜方法與7種成分的含量檢測(cè)方法以及溶出度的測(cè)定方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、科學(xué)，可用于沙菊茶的質(zhì)量控制并指導(dǎo)“三高”患者正確使用該茶。

附表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果