呂云 顧超?

肺泡結構破壞與丟失、氣腔的擴大和肺彈性組織的降解是引起肺氣腫或慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者氣流受限的重要原因［1］。吸煙是引起肺氣腫和COPD的最主要危險因素。如何修復損傷的肺組織，并使丟失的肺泡再生是肺氣腫和COPD治療的關鍵和難點。目前尚無有效的藥物阻止COPD患者肺功能下降。羊水間充質干細胞（AF-MSCs）是羊水干細胞中的一種，具有廣泛的分化潛能，能分化為神經細胞、脂肪細胞、骨細胞、心肌細胞等［2-3］。羊水干細胞在合適的龕位環(huán)境中可能會整合至特定的組織中并定向分化［4-5］。本課題組前期研究表明，AF-MSCs在體外能通過特定的誘導定向分化為II型肺泡上皮細胞（AECII）［6］。本研究通過AF-MSCs移植入大鼠肺組織中，檢測其對肺氣腫大鼠肺功能的改善情況及相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 （1）實驗動物：清潔級妊娠SD大鼠10只，孕期（13±1）d，體重300～350g，清潔級雄性SD大鼠60只，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心。本研究經浙江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。大鼠AF-MSCs由本課題組保存。（2）主要試劑：TRIzol購于美國Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒購于日本TaKaRa公司；β-actin、兔抗大鼠肺表面活性蛋白SPA及SPC抗體、羊抗兔IgG二抗購于美國Santa Cruz公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購于江蘇碧云天公司；PVDF膜購于美國Bio-Rad公司；eECL高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒購于北京康為世紀公司。

1.2 方法 （1）大鼠AF-MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定：根據(jù)本課題組前期研究方法［6］分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠AF-MSCs。（2）肺氣腫大鼠模型建立及AF-MSCs移植：將60只清潔級雄性SD大鼠隨機平均分為A、B、C、D 4組，每組各15只。A組（正常對照組）、B組（肺氣腫組）、C組（AF-MSCs移植30d組）、D組（AF-MSCs移植60d組）；按照本課題組前期方法［7］建立肺氣腫大鼠模型，建模時間每周7天，共12周。大鼠建模結束后第2天，C組和D組大鼠用5%異氟醚短暫麻醉大鼠，固定后使大鼠頭后仰70°，鑷子緩慢夾出大鼠舌頭，將靜脈留置針的塑料套管插入氣管，快速滴入200μl的AF-MSCs懸液（約4×106個細胞），而后注入少量空氣以保證全部液體進入氣管，將大鼠豎起并適度搖動使藥液分布均勻，注意保溫，待大鼠清醒后放回飼養(yǎng)籠；而A組和B組大鼠氣管內吸入200 μl無菌PBS。（3）大鼠肺功能測定：采用小動物肺功能儀測定各組大鼠肺功能，麻醉消毒后固定，切開頸部皮膚，將氣管倒T型切開，食道插管經口插入食道中部，并連接壓力傳感器記錄食道壓（即胸腔負壓），Y型套管氣管插管后，分別連接至微型壓力傳感器和呼吸流量傳感器記錄氣道壓和呼吸流量。觀察食道壓、氣道壓和呼吸流量，采集信號良好的波形10 min，通過MPA肺功能分析系統(tǒng)計算并取平均值。（4）肺組織病理學檢測：各組大鼠完成肺功能檢測后立即用10%水合氯醛腹腔內麻醉處死各組大鼠，對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。取各組大鼠左肺組織蠟塊常規(guī)切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，按照本課題組前期方法［7］，肺組織病理半定量分析肺泡平均內襯間隔（mlI）及平均肺泡面積（MAA）。（5）Real-time PCR檢測SPA及SPC mRNA水平：收集各組大鼠右肺組織，按照試劑盒說明書合成cDNA，行Real-time PCR，以GAPDH為內參；以2-ΔΔCt分析目的基因相對表達差異。引物序列：SPA正義鏈5'-TCGGTGTCCCAGGATTTAG-3'，反 義 鏈 5'-CAGGGTGGCTGCTGTTAGT-3'；SPC正 義 鏈5'-CAGACACCATCGCTACCTT-3'， 反 義鏈 5'-TAGCCAAAGCCTCAAGACT-3'；GAPDH 正義鏈5'-GTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，反義鏈5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'。（6）Western blot檢測SPA和SPC蛋白表達：取各組大鼠右肺新鮮肺組織約100 g提取總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，取含20μg蛋白樣品變性后上樣至8%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中，常規(guī)電泳、轉膜及封閉后，加入1：200稀釋的兔抗人SPA或SPC抗體孵育，后加入1：2000稀釋辣根酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）孵育，最后在UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)掃描并攝像，圖像灰度分析。將各目的蛋白的吸光度值與β-actin內參條帶吸光度值的比值作為各蛋白的相對表達量。（7）衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性檢測：以染色法檢測各組大鼠肺組織SA-β-gal活性，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包。計量資料以（）表示，統(tǒng)計學分析采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺功能AR、Cdyn和PEF比較 見表1。

表1 各組大鼠肺功能AR、Cdyn和PEF比較［n=15，（）］

表1 各組大鼠肺功能AR、Cdyn和PEF比較［n=15，（）］

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

組別 AR［cm/（ml·s）］ Cdyn（ml/cm） PEF（ml/s）A組 0.134±0.021 0.302±0.025 13.191±1.727 B組 0.334±0.026* 0.174±0.012* 6.796±1.379*C組 0.257±0.027*# 0.200±0.028*# 9.902±3.132*#D組 0.240±0.035*# 0.250±0.031*# 11.304±2.518#F值 43.052 52.232 6.910 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 大鼠肺組織病理學改變 各組大鼠肺組織常規(guī)HE染色結果顯示，B組、C組和D組均出現(xiàn)肺氣腫征象：大部分肺泡呈囊狀擴張，肺泡腔不規(guī)則擴大且大小不一，相同視野內肺泡數(shù)目明顯減少；部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合。AF-MSCs移植后肺組織肺氣腫改變程度明顯減輕，并且移植后60 d（D組）與移植后30 d（C組）比較，肺氣腫征象改善更明顯，見圖1；肺組織病理半定量分析證實B組肺組織mlI和MAA明顯高于A組（P＜0.05），而AF-MSCs移植后（C組和D組）大鼠肺組織mlI和MAA明顯低于B組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠肺組織mlI及MAA變化（n=15，）

表2 各組大鼠肺組織mlI及MAA變化（n=15，）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

組別 mlI（μm） MAA（μm2）A組 63.56±13.44 4910.78±476.66 B組 120.72± 9.47* 12379.48±1254.63*C組 83.16±9.08# 9850.74±280.60#D組 71.52±10.24 # 8108.74±324.08#F值 27.982 99.140 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖1 各組大鼠肺組織病理學改變（HE染色，×200）

2.3 大鼠肺組織SPA及SPC mRNA水平分析 Realtime PCR檢測各組大鼠肺組織SPA和SPC mRNA表達，結果顯示：SPA和SPC mRNA在A組中呈高表達，而在B組中的表達顯著降低（P＜0.05）；而AF-MSCs移植后（C組和D組），SPA和SPC mRNA表達明顯高于B組（P＜0.05），并且D組表達高于C組。

2.4 大鼠肺組織SPA及SPC蛋白表達水平 Western blot檢測各組大鼠肺組織SPA和SPC蛋白表達水平，結果顯示：SPA和SPC蛋白在B組中表達顯著低于A組（P＜0.05）；AF-MSCs移植后（C組和D組），SPA和SPC蛋白表達明顯高于B組（P＜0.05），并且D組表達高于C組；其結果與SPA和SPC mRNA在各組大鼠肺組織中的表達相一致。

2.5 大鼠肺組織SA-β-gal活性改變 以染色法檢測各組大鼠肺組織SA-β-gal活性，肺組織中染色成藍色的細胞為SA-β-gal陽性細胞，即衰老的細胞，大多數(shù)位于肺泡角部。與A組比較，B組中SA-βgal陽性細胞明顯增多；而AF-MSCs移植后（C組和D組），SA-β-gal陽性細胞減少，且D組減少更明顯，見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織SA-β-gal活性改變（×400）

3 討論

預計到2020年，COPD將是全球死亡原因的第三位因素［8］，在我國＞40歲人群中患病率高達8.2%［9］。COPD發(fā)病機制非常復雜，病變累及氣道、肺實質和肺血管等結構，呈進行性發(fā)展。近年來研究表明，肺泡上皮細胞衰老和細胞凋亡是COPD重要的發(fā)病機理［10-12］。越來越多研究表明，細胞衰老在COPD患者中加速，并促進COPD進展［13-14］。目前尚無有效藥物阻止COPD患者肺功能長期下降［8］。

哺乳動物的肺泡上皮細胞由I型肺泡上皮細胞（AECI）和AECII組成。AECII不僅可分化為AECI，還可通過有絲分裂補充自身數(shù)量；同時AECII還具有合成和分泌肺泡表面活性蛋白、維持肺泡內外液體平衡、免疫調節(jié)等作用［6］。肺泡表面活性蛋白包括SPA、SPB、SPC和SPD，其中SPA和SPC是AECII特異性表達的。本研究中，肺氣腫大鼠肺功能明顯下降，肺組織出現(xiàn)肺氣腫征象，包括大部分肺泡呈囊狀擴張，肺泡腔不規(guī)則擴大且大小不一，相同視野內肺泡數(shù)目明顯減少；部分肺泡間隔斷裂，肺泡融合；并且肺組織中SPA和SPC的mRNA及蛋白表達顯著降低。SA-β-gal被認為是細胞衰老的重要生物標記。本研究中，肺氣腫大鼠肺組織中SA-β-gal陽性細胞明顯增多，提示肺氣腫大鼠肺功能的下降和病理學的改變與AECII 的衰老相關。

隨著干細胞研究的不斷深入，干細胞再生治療研究也取得突破性進展。De Coppi等［2］首次報道從羊水中分離到具有多向分化潛能的干細胞，羊水作為干細胞新的來源在組織工程學及再生醫(yī)學方面成為新的研究熱點。本課題組前期研究中成功在妊娠大鼠中分離得到AF-MSCs，并證明其在體外能通過特定的誘導定向分化為AECII［6］。過早細胞衰老會顯著影響肺部祖細胞功能，使其失去組織修復功能，導致干細胞耗竭、肺組織損傷［13-14］。肺氣腫患者內皮細胞端粒長度顯著縮短，且肺泡細胞衰老水平與其氣流受限程度正相關［10］。本研究中，將AF-MSCs移植入肺氣腫大鼠肺組織中后，其肺功能顯著好轉，肺組織肺氣腫征象得到改善，SPA和SPC的mRNA及蛋白表達顯著上升，SA-β-gal陽性細胞明顯減少，并且AF-MSCs移植60d后上述改善更加明顯。

綜上所述，AF-MSCs移植能改善肺氣腫大鼠肺功能，并促進肺組織修復，其機制可能與AF-MSCs進入肺組織后分泌某些物質來抑制AECII衰老相關，或者與AF-MSCs移植后在肺組織中定植并在適當條件下定向分化為AECII有關。但是，調控AF-MSCs上述功能的信號轉導機制有待于進一步研究。