萬鳳 楊汝春? 時延朋 張華琴

腎小管間質(zhì)纖維化（TIF）是各種慢性腎臟病（CKD）進展至終末期腎?。‥SRD）的共同通路和主要病理特征［1］。研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）是TIF發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)［2］。EMT受多種生長因子和細胞因子的調(diào)節(jié)，其中最重要的是轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）。實驗表明TGF-β1參與多數(shù)腎臟病中進展性腎纖維化的病理形成［3］。目前，有關桑黃提取物在腎小管上皮細胞EMT發(fā)生中的作用研究尚未見報道。因此，本文以大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E細胞為研究對象，觀察桑黃PA、PW和PP對TGF-β1誘導的NRK-52E細胞EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細胞株：大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E，購于中國科學院細胞庫，細胞系目錄號GNR 8。（2）藥物與試劑：PA、PW和PP均由浙江省農(nóng)業(yè)科學院提供。胎牛血清（Gibco），DMEM低糖培養(yǎng)基，0.25%胰酶-EDTA，雙抗、CCK-8試劑盒均購自杭州達文生物有限公司；RT-PCR引物由上海生工生物有限公司合成。TGF-β1（R＆D公司），TRIzol reagent（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTM均自TaKaRa公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和0.1g/L鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，進行換液1次/1～2d。當細胞生長融合至80%～90%融合時，用含0.25%胰酶-EDTA溶液進行消化細胞，吹打均勻并傳代。

1.3 CCK-8法測定NRK-52E細胞存活率 消化收集對數(shù)增殖期NRK-52E細胞并以1×108/L的密度接種于96孔板，每孔100μl，細胞貼壁后用無血清培養(yǎng)基同步化24h。之后實驗組分別加入不同濃度的采用含2%FBS DMEM培養(yǎng)基配制的倍比稀釋的PA、PW和PP，每孔100μl，終濃度分別為1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和 400μg/ml，對照組加入等體積2% DMEM培養(yǎng)基，每組設置6個復孔。培養(yǎng)48h后每孔加入10μl CCK-8 溶液，37℃反應2h后于450nm波長處檢測每孔吸光度值。細胞生存率及增殖抑制率按如下公式計算：生存率（%）=（實驗組OD值/對照組OD）×100%。抑制率（%）=（1-生存率）×100%。

1.4 實驗分組 將NRK-52E接種在6孔板中，當細胞密度達到70%左右時進行無血清同步化處理24h，之后將NRK-52E細胞隨機分為5組：（1）對照組。（2）誘導組：只添加10ng/mlTGF-β1。（3）PA干預組：10ng/ml TGF-β1+100μg/ml PA。（4）PW干預組：10 ng/ml TGF-β1+200μg/ml PW。（5）PP干預組：10ng/ml TGF-β1+200 μg/ml PW。

1.5 RT-PCR檢測EMT相關基因mRNA水平的表達 PA、PW和PP分別處理NRK-52E 24 h，收集細胞，TRIZOL法提取細胞總RNA，分光光度計測定RNA濃度。取所提取的2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進行熒光定量PCR，GAPDH作為內(nèi)參。E-cadherin的上游引物：AACAACTGCATGAAGGCGATCTCC，下游引物TTGACCACCGTTCTCCTCCGTAG，擴增產(chǎn)物長度137bp；α-SMA的上游引物：GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC，下 游 引 物：CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC， 擴增產(chǎn)物長度為150bp；Desmin的上游引物：AATGACCGCTTCGCCAACTACTTC， 下 游 引 物：GCTCTCGCATCTCCTCCTCGTAG，擴增產(chǎn)物長度為139 bp；GAPDH的上游引物：ACCACAGTCCATGCCATCAC，下游引物：TCCACCACCCTGTTGCTGTA，擴增產(chǎn)物長度為453 bp。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，方差齊者，多組間采用one-way ANOVA，組間兩兩比較用LSD法；如方差不齊，采用Tamhane's T2。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PA對NRK-52E細胞增殖的影響 CCK-8結(jié)果顯示，與對照組比較，低濃度的PA對NRK-52E細胞無明顯的抑制作用，當濃度達到200μg/ml時，PA可顯著抑制NRK-52E的增殖效應，抑制率達到56%，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。當PA濃度達到400μg/ml時，其對NRK-52的抑制率高達68%，較對照組差異性顯著（P＜0.01）。

2.2 PW對NRK-52E細胞的增殖效應 CCK-8結(jié)果顯示，與對照組比較，低濃度的PW對NRK-52E細胞無明顯的抑制作用，當濃度達到400μg/ml時，PW可顯著抑制NRK-52E的增殖作用，抑制率達到50%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3 PP對NRK-52E細胞的增殖效應 CCK-8結(jié)果顯示，與對照組比較，低濃度的PP對NRK-52E細胞無明顯的增殖效應，當濃度達到12.5μg/ml和25μg/ml時，其增殖率分別達到175%和176%，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。然而，隨著濃度的繼續(xù)增加，其增殖作用趨于減弱。當濃度達到400μg/ml時，PP反而抑制NRK-52E的增殖效應，抑制率達到38%（P＜0.05）。

2.4 桑黃不同濃度提取物對NRK-52E細胞EMT相關基因mRNA表達的影響 基于CCK-8結(jié)果，分別選取100μg/ml PA、200μg/ml PW和200μg/ml PP用于后續(xù)的EMT干預實驗。RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1誘導組中α-SMA和desmin的表達均較正常組明顯增加（P＜0.01），E-cadherin則較正常組顯著降低（P＜0.01）。而經(jīng)PA、PW和PP干預之后，NRK-52E細胞中的α-SMA和desmin較模型組明顯降低（P＜0.01或 P＜0.05），E-cadherin 表達增加（P＜0.01 或 P＜0.05），其中PP的干預效果最佳。綜上，PA、PW和PP均可抑制NRK-52E細胞的EMT作用。見圖1-3。

3 討論

圖1 桑黃不同提取物對α-SMA表達的影響（與對照組比較，??P＜0.01；與TGF-β1模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01）

圖2 桑黃不同提取物對demin表達的影響（與對照組比較，??P＜0.01；與TGF-β1模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01）

圖3 桑黃不同提取物對E-cadherin表達的影響（與對照組比較，??P＜0.01；與TGF-β1模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01）

桑黃，又稱桑臣、桑耳、桑黃菇等，是寄生于桑樹等闊葉樹的一種藥用真菌。桑黃的主要成分包括多糖、甾體、黃酮類物質(zhì)、酚類物質(zhì)、萜類、香豆素類物質(zhì)及生物堿［4］。桑黃具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化［5］、抗血管生成［6］、降血糖［7］、自由基清除［8］、免疫調(diào)節(jié)［9］和抗腫瘤作用［10］。桑黃是活血化瘀藥，其子實體入藥，味微苦，性寒，具有活血、化飲、補虛、清熱解毒之功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明多糖、黃酮和萜類是其主要活性成分。桑黃是一種珍貴的藥用真菌，已吸引國內(nèi)外越來越廣泛的關注。研究證實桑黃具有抗腫瘤、抗肝纖維化和抗氧化等作用。桑黃的抗肝纖維化作用在動物實驗中已得到證實。然而，桑黃是否具有抗腎纖維化作用尚未見報道。

在本研究中，首先評估了不同濃度PA、PW和PP對NRK-52E細胞增殖的影響。在此基礎上，作者分別選取了100μg/ml PA、200μg/ml PW和200μg/ml PP三個對細胞無毒副作用的濃度用于后續(xù)的EMT干預實驗。RT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1組中E-cadherin較正常組明顯降低，而α-SMA和desmin較正常組明顯增加。而經(jīng)PA、PW和PP干預之后，NRK-52E細胞中E-cadherin表達較TGF-β1組明顯上調(diào)，α-SMA和desmin則明顯降低，其中以PP的效果最為明顯，推測PP可能是桑黃中抑制NRK-52E發(fā)生EMT最有效的成分。

綜上所述，桑黃不同提取物可抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞EMT的發(fā)生。EMT是一個錯綜復雜的過程，阻斷其中任何一個環(huán)節(jié)均有可能抑制其進程。本文僅檢測了EMT發(fā)生的下游效應因子，其具體機理尚不明確，還有待于進一步的探究。