朱炳偉 劉永林? 彭來君

骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組起源于造血干細胞的異質(zhì)性髓系克隆性疾病，其主要特點是髓系細胞分化及發(fā)育異常，表現(xiàn)為無效造血、難治性血細胞減少、造血功能衰竭，轉變?yōu)榧毙运柘蛋籽。ˋML）的風險性較高［1-2］。染色體異常克隆是MDS的特點之一，應用常規(guī)染色體核型分析（CC）能發(fā)現(xiàn)約40%～70%的MDS患者存在非隨機的染色體異?？寺?。本研究對70例MDS患者骨髓進行5、7、8、20號和Y染色體熒光探針信號分析，并與CC結果進行比較，觀察不同類型MDS患者的染色體異常，初步探討FISH技術在診斷MDS中的價值。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2013年3月至2015年10月在浙江省中醫(yī)院血液科就診的符合維也納最低診斷標準［3］的MDS患者70例，其中男39例，女31例；年齡17～83歲，中位年齡 55歲。按 WHO 2008分型［4］：難治性貧血（RA）20例，難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細胞（RAS）4例，難治性血細胞減少伴多系發(fā)育異常（RCMD）17例，難治性貧血伴原始細胞過多-1（RAEB-1）13例，難治性貧血伴原始細胞過多-2（RAEB-2）10例，5q-綜合征1例，骨髓增生異常/骨髓增殖性疾?。∕DS/MPN）2例，不能分類的MDS（MDS-U）3例。另選取10例在本院就診的良性骨科疾病患者的骨髓細胞作為對照。

1.2 試劑與儀器 熒光原位雜交技術（FISH）試劑盒（批號：CNG0007）購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公 司， 包 括 GLP CSF1R/GLP D5S23，D5S721；GLP EGR1/GLP D5S23，D5S721；GLP D7S486/CSP7；GLP D7S522/CSP7；GLP D20S108/CSP8和 CSP X/CSP Y共6組探針，熒光顯微鏡型號OLYMPUS BX-UCB，熒光原位雜交儀型號ABBOTT ThermoBrite。

1.3 常規(guī)染色體核型分析 抽取抗凝骨髓適量采用骨髓短期培養(yǎng)法進行細胞培養(yǎng)，每例標本選取≥20個中期分裂相細胞進行R顯帶核型分析，染色體核型描述按《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN2013）》進行。

1.4 熒光原位雜交檢測及閾值的建立 取抗凝骨髓液2ml，以0.075mol/L KCI溶液低滲處理后，以3：1甲醇冰醋酸溶液預固定，制備細胞懸液滴片、烤片，制備探針混合物，變性、加探針雜交、洗滌玻片并復染，立即蓋上蓋玻片。放在暗處15min后，在熒光顯微鏡下觀察間期細胞的熒光信號，每份樣本計算200個細胞。FISH閾值的建立： 采用良性骨科疾病患者的骨髓細胞10例設為正常對照組建立各探針的檢測閾值。異常閾值=平均值

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FISH與CC總檢出率比較 70例MDS患者中，聯(lián)合應用兩種方法共檢出40例染色體異常，總陽性率為57.1%，其中FISH檢測出35例染色體異常，陽性率為50.0%，CC檢測出27例染色體異常，陽性率為38.6%。兩種方法檢測結果相一致的患者有52例（74.3%），其中FISH與CC均正?；颊?0例（42.9%），F(xiàn)ISH與CC均異?；颊?2例（31.4%）；兩種方法檢測結果不一致的患者有18例（25.7%），其中CC異常而FISH 正?；颊?例（7.1%），異常均分布在FISH探針檢測區(qū)域以外（見表1）；FISH異常而CC正?；颊哂?3例（18.6%），其中20q-和7q-異常各6例，5q-和+8異常各3例（見表2）。

表1 5例FISH正常而CC異常MDS患者

表2 13例CC正常而FISH異常MDS患者

2.2 FISH與CC對MDS常見染色體異常檢出率比較 見表3。

表3 FISH與 CC對MDS常見染色體異常檢出率的比較［n（%）］

2.3 染色體異常與WHO分型（2008）的關系 見表4。

表4 染色體與WHO分型（2008）的關系［n（%）］

3 討論

MDS 的染色體異常主要以染色體缺失和數(shù)目異常（增加或丟失）為主，尤其是+8、-7/7q-、-5/5q-、20q-和-Y等5種最為常見，而染色體易位則較少見，約為5%［5］。本研究對所有70例MDS患者使用了6組覆蓋上述5種MDS常見染色體異常的FISH探針進行檢測，并與CC結果相比較。結果顯示，CC染色體異常檢出率僅有38.6%，稍低于國內(nèi)外報道的異常比例，可能是由于43例CC正常的MDS患者中有3例可供分析的分裂象數(shù)目不足，故可能存在漏檢，降低了染色體異常檢出率。而FISH技術的染色體異常檢出率高達50.0%，要明顯高于CC。FISH技術檢測顯示最常見的染色體異常為20q-（20.0%）和+8（17.1%），其它異常檢出率依次為-7/7q-（15.7%），-5/5q-（12.9%）和-Y（2.9%），染色體異常分布頻率的順序與國內(nèi)李樂勒等［6］研究的結果基本一致，但與其它國家報道有較大差別。西方報道染色體異常中最常見的染色體依次為 -5/5q-，+8，-7/7q-，20q-，17p-，11（q23）異常及復雜或高度復雜異常核型等［7］，與本研究結果不符，這可能是和兩者之間不同的種族和地域之間的差異有關。CC檢測顯示最常見的染色體異常為+8（10.0%）和20q-（8.6%），其它異常檢出率依次為-5/5q-（7.1%）、-7/7q-（7.1%） 和 -Y（4.3%），F(xiàn)ISH 技 術較CC將-5/5q-，-7/7q-，20q-和+8這4組染色體異常檢出率分別由7.1%、7.1%、8.6%、10.0%提高至12.9%、15.7%、20.0%、17.1%，該結果表明FISH技術檢測MDS患者-5/5q-，-7/7q-，20q-和+8的敏感性要高于常規(guī)染色體核型分析。

本研究70例樣本兩種方法檢測共有52例（74.3%）結果一致，30例兩種方法檢測均為陰性，22例兩種方法檢測均為陽性，其中7例患者CC除檢測出FISH的異常核型外，檢測異常還累及1、4、9、13、15、16、17、18、20和22號染色體，說明CC比FISH能發(fā)現(xiàn)更多結構與數(shù)目異常，而本研究中使用的是間期 FISH，由于探針設計范圍有限，一次只能檢測一個或幾個位點的已知異常，如果染色體異?？寺≡谔结樤O計范圍之外，就無法檢測到。本研究70例樣本兩種方法檢測結果不符的患者有18例（25.7%），其中5例患者CC異常而FISH正常，這5例染色體異常均分布在FISH探針檢測區(qū)域以外（見表1）；CC正常的MDS患者中由 FISH檢測出了13例異常，核型分析出現(xiàn)漏報現(xiàn)象，其中20q-和7q-異常各漏報6例，5q-和+8異常各漏報3例，F(xiàn)ISH對其中的5q-、7q-、20q-和+8這些CC漏報的染色體異常都能夠準確檢測出。其中10例樣本FISH檢測陽性細胞百分率僅為7.0%～16.0%，表明該10例患者體內(nèi)可能存在小克隆的隨機染色體異常改變，通過CC法容易漏檢，余下的3例樣本經(jīng)FISH檢測結果顯示，陽性細胞百分率分別達到 32.0%、34.0% 和60.0%，但CC仍然漏檢，這可能是由于可供核型分析的中期分裂相數(shù)量不足。因此，作者認為對于核型正?；蛘吆诵褪〉腗DS患者，F(xiàn)ISH仍可以檢測出10%～20%左右的染色體異?？寺?，F(xiàn)ISH 技術對于那些骨髓細胞少，分裂相不理想的標本尤其適合，檢測敏感性更高。

本研究中70例MDS患者按WHO分型，其中RA比例最高，占20例（28.6%），其它分型依次為RCMD 17例（24.3%），RAEB-1 13例（18.6%），RAEB-2 10例（14.3%）和RAS 4例（5.7%）。根據(jù)FISH檢測結果顯示，在WHO分型各亞型中，染色體異常檢出頻率是不一致的，RA、RCMD、RAEB-1、RAEB-2和RAS的染色體異常檢出頻率由低到高依次為30.0%、47.1%、53.8%、60.0%和75.0%，可見MDS的分型與染色體異?？寺z出率相關，且異常克隆檢出率隨著病情的發(fā)展有增加的趨勢。而CC法 RA、RCMD、RAEB-1、RAEB-2和RAS的染色體異常檢出頻率依次 為 15.0%、7.6%、69.2%、50.0%和 50.0%，CC除RAEB-1型染色體異常檢出率要高于FISH以外，其它異常檢出率均低于FISH，表明FISH技術在檢測MDS各亞型中染色體異常的敏感性要高于CC。

綜上所述，F(xiàn)ISH技術對MDS 常見染色體異常檢測的敏感性要比CC高，但是FISH技術因包含探針有限，不能完全替代CC在MDS檢測中的作用，可以成為染色體核型分析的有益補充，對于那些CC檢測失敗或者正常的病例，有較高的應用價值。