王金炫 王小平

江蘇省句容市糧食局中心化驗室 江蘇句容 212400

嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，它主要有兩類：一類是赤霉致嘔毒素，能引起嘔吐；另一類是赤霉烯酮具有雌激素的作用。這些毒素主要存在于麥粒的糊粉層和皮部，故以麥麩和面筋中較多，胚乳淀粉中較小?！妒称钒踩珖覙藴?食品中真菌毒素限量》GB 2761—2017規(guī)定食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）限量指標為1000 μg/kg。國家糧食局每年進行的夏秋兩季糧食收獲質(zhì)量、衛(wèi)生調(diào)查，就是保障我國糧食質(zhì)量衛(wèi)生安全。

句容市糧食局中心化驗室擔負著江蘇省糧食局下達的國家糧食局夏秋兩季收獲質(zhì)量、衛(wèi)生調(diào)查和品質(zhì)測報任務(wù)，從收獲入庫到生產(chǎn)加工等環(huán)節(jié)進行嚴格把關(guān)，把小麥中嘔吐毒素控制在食品安全國家標準限量以內(nèi)。2018年夏糧共檢測小麥樣品300余份，實驗中掌握了GB 5009.111—2016免疫親和層析凈化高效液相色譜法嘔吐毒素測定的操作要領(lǐng)，應(yīng)用分析如下。

1 測定原理與儀器和試劑

1.1 測定原理

小麥檢測樣品中的嘔吐毒素經(jīng)水提取、免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜紫外檢測器測定。樣品溶液中各組分經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式展現(xiàn)出來；再用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行處理，按保留時間定性，外標法定量而得知被測組分含量。

1.2 測定儀器和試劑

安捷倫126液相色譜儀配有VWD熒光檢測器；感量0.01 g、0.0001 g天平；試管研磨機、離心機、超聲洗滌儀等；250 μL、1000 μL 移液槍；玻璃纖維濾紙、0.45 μm水相微孔濾膜、25 mL注射器、50 mL刻度離心管、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱。

甲醇-水溶液（30+70）：量取15 mL甲醇加入到35 mL水中混勻，使用前脫氣30 min；10%異丙酮：量取1 mL異丙酮定容至10 mL；標準品梯度的設(shè)置：待測物響應(yīng)值應(yīng)在標準曲線線性范圍內(nèi)，相當樣品濃度 μg/kg 0、300、600、1200、1800、2400（分別吸取濃度為 1.007 μg/mL 標準使用液 0、0.075、0.150、0.300、0.450、0.600 mL，甲醇-水配至 1.5 mL）。

2 樣品制備

2.1 檢測樣品

檢測樣品為本市收獲質(zhì)量衛(wèi)生調(diào)查和夏糧入庫樣品共300余份，檢測時間5月21日開始至6月30日，檢測小麥類型均為混合小麥。

2.2 樣品預(yù)處理

2.2.1 去雜。雜質(zhì)是指小麥以外的其它物質(zhì)，包括篩下物、無機雜質(zhì)和有機雜質(zhì)。首先分取大樣1200 g，分四次篩選，每次數(shù)量約300 g，撿出篩上大型雜質(zhì)并棄除下層篩篩下物，合并上下層篩上的糧食籽粒測定容重；然后再進行分樣，部分樣品留作水分和不完善粒測定，部分樣品按質(zhì)量標準規(guī)定撿出所有雜質(zhì)后為凈小麥，留作粉碎。

2.2.2 粉碎。取不少于500 g樣品，用試管研磨機將其粉碎（細度通過20目）混合均勻后縮分至100 g，儲存于樣品瓶中，密封保存，供嘔吐毒素提取用。

2.3 檢測方法

水分測定按GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》方法進行；容重測定按GB/T 5498—2013《糧食檢驗 容重》方法進行；不完善粒測定按GB/T 5494—2008《糧食檢驗 糧食、油料的雜質(zhì)、不完善粒檢驗》方法進行；嘔吐毒素測定按GB 5009.111—2016《食品安全國家標準食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》中第二法《免疫親和層析凈化高效液相色譜法》進行。

3 測定步驟與結(jié)果

3.1 試樣提取

按脫氧雪腐鐮刀菌烯醇免疫親和柱使用說明書操作，具體步驟如下：

稱取小麥粉碎樣品25 g（準確到0.1 g）于250 mL具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，加水125 mL混勻，置振蕩器振蕩20 min。提取液倒入試管中離心10 min（6000 r/min），上清液用玻璃纖維濾紙過濾，收集濾液于50 mL刻度離心管中。

樣品濾液凈化。將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫，拔出堵頭流盡免疫親和柱內(nèi)原有液體，準確移取樣液2.5 mL于親和柱中，連接注射器樣液以每秒1滴流速通過親和柱；樣液流盡后吸取20 mL水于注射器中以每秒2滴的流速通過免疫親和柱，直至空氣進入親和柱中，抽干小柱。

樣品凈化液洗脫。注入1.5 mL甲醇于親和柱中以每秒1滴流速進行洗脫，然后將洗脫好的樣液倒入注射器針筒，連接0.45 μm水相微孔濾膜和液相上機小瓶，洗脫液通過濾膜進入小瓶，再以1∶1洗脫液和水進行稀釋混勻待測。

3.2 安捷倫126液相色譜儀參考條件

色譜柱：Eclipse XDB—C18，4.6×25 mm，5 μm；流動相：甲醇:水（30∶70）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：50 μL；檢測波長：218 nm；樣品采集時間：10 min。

表1 部分小麥樣品嘔吐毒素檢測結(jié)果

3.3 開機

3.3.1 軟件操作（雙擊軟件用首次創(chuàng)建的方法）

首先管沖洗：開啟儀器狀態(tài)準備就緒后，四元泵右擊方法，扭松排液閥，改流量5.000，A管應(yīng)用（約2 min氣泡排完）；B管輸100應(yīng)用，氣泡排空后改0，C管D管依次沖洗。

然后柱沖洗：改流量 1.000，改 B 管 30（30∶70 甲醇水為流動相）應(yīng)用，關(guān)排液閥，沖洗20 min。

樣品盤設(shè)置（P1盤和P2盤可隨意放置）：如采用P1盤可以P1a1空白；P1a2至P1a7校正標準；P1a8樣品依次排列。

3.3.2 樣品檢測

在線信號選擇VWD，去掉FLD，基線走平后點運行；樣品自動檢測。

3.3.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)選擇：方法右擊關(guān)聯(lián)全部，信號FPD（關(guān)掉ECD）；打開數(shù)據(jù)今天的所有標樣和樣品，選用GC/CC定量，調(diào)用前處理，方法另存輸文件名保存。

看色譜圖：看被測物出峰時間刪去多余雜峰，應(yīng)用空白扣除，所有進樣，使用指定空白確定；點擊色譜圖中的留用峰，峰作為化合物添加到方法；輸入有關(guān)信息，點重新處理全部。

查看數(shù)據(jù)處理：峰詳細信息、色譜圖、校正曲線、樣品信息、進樣結(jié)果。

3.4 檢測結(jié)果

3.5 關(guān)機

清洗管路：點擊儀器狀態(tài)把A管純水瓶中管路放入甲醇瓶中，四元泵右擊方法，旋排空閥去掉B管，改流速改為5 mL，沖洗5 min；沖柱子：流量改為1，關(guān)排空閥沖洗20 min；打開另一軟件，關(guān)閉連接、確定、否，關(guān)閉圖譜、關(guān)檢測器、關(guān)主機。

4 檢測質(zhì)量控制

應(yīng)用GB 5009.111測定嘔吐毒素含量，為確保檢測結(jié)果的準確性和可靠程度，對檢測工作過程的各個環(huán)節(jié)進行有效控制，確認儀器的性能及整個檢測工作質(zhì)量是否滿足實驗要求。

4.1 加標回收試驗

免疫親和層析凈化高效液相色譜法測定嘔吐毒素法樣品前處理比較復(fù)雜，操作稍有不當就會使樣品含量損失或污染，加標回收是最好的驗證方法。通過回收率找出實驗中各環(huán)節(jié)存在的問題，以確定其檢測方法的適用程度。加標要從樣品提取開始，進行空白加標、試樣加標、洗脫過濾后樣液三種類型加標。實驗結(jié)果：空白加標回收106.6%、試樣加標回收102.1%、洗脫后樣液加標回收99.97%；符合GB/T 27404—2008附錄F回收率80.0%～110.0%規(guī)定；證明免疫親和層析凈化高效液相色譜法測定嘔吐毒素檢測方法適用。

4.2 人員比對

進行人員比對同一樣品，相同儀器，不同人員進行操作，衡量人員操作技術(shù)水平是否符合規(guī)范要求。

從表2中可以看出，應(yīng)用GB 5009.111法測定嘔吐毒素操作正確、技術(shù)過關(guān)、數(shù)據(jù)準確，符合GB 5009.111重復(fù)條件下兩次獨立測定結(jié)果絕對差值不得超過算術(shù)平均值的23%規(guī)定要求。

表2 不同人員之間測定驗證數(shù)據(jù)表

5 應(yīng)用與分析

應(yīng)用GB 5009.11法測定無機嘔吐毒素含量，一是流動相必須脫氣處理，以提高檢測靈敏度；二是選擇合適標準曲線梯度，取得標準品良好線性；三是選擇適合流動相，以獲得較好峰形；四是進行質(zhì)量控制，保證檢測工作質(zhì)量。

5.1 脫氣處理流動相提高檢測靈敏度

流動相使用前必須進行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體，以防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。

5.2 選擇合適標準曲線梯度取得良好線性

實踐中不斷摸索，選用合適的標準梯度，保證樣液中待測物的響應(yīng)值應(yīng)在標準曲線線性范圍內(nèi)，使校正曲線相關(guān)系數(shù)達0.999以上，確保樣品檢測結(jié)果的科學(xué)性、準確性。

5.3 選擇適合流動相以獲得較好峰形

改善峰形，是提高靈敏度和定量分析精確度的目的。實際分析過程中，需要根據(jù)實驗室條件和具體情況進行調(diào)整流動相的配比，樣品出峰時間和峰形與流動相極性有很大關(guān)系，峰的保留時間6至15 min為宜；色譜峰區(qū)域?qū)挾?，是反?yīng)色譜分離條件好壞的重要參數(shù)，使其達到峰高的0.607處的要求。

5.4 進行質(zhì)量控制保證方法準確應(yīng)用

加標回收試驗和開展技術(shù)核查是確保檢測工作質(zhì)量的具體措施，是衡量檢測人員的業(yè)務(wù)技術(shù)水平，驗證選用的檢測方法是否得當，了解儀器性能的掌握情況，使之能夠更好地應(yīng)用方法，掌握操作技能，確保檢測工作質(zhì)量目標的實施。

綜上所述，免疫親和層析凈化高效液相色譜法測定嘔吐毒素，要做到實驗環(huán)境滿足儀器運行條件，操作人員掌握技術(shù)要領(lǐng)，采取必要的質(zhì)量控制技術(shù)以核查驗證符合要求，才能確保準確應(yīng)用。