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        南蛇藤多萜對4種化療藥物增效作用的實驗研究

        2018-12-17 07:47:34劉延慶
        江蘇中醫(yī)藥 2018年12期
        關(guān)鍵詞:耐藥劑量

        陶 麗 劉延慶

        (1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇揚州 225001; 2.國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室,江蘇揚州 225001)

        化療是目前治療癌癥最有效的手段之一,但針對腫瘤耐藥后出現(xiàn)的疾病進展,臨床尚無替代性的良策,給癌癥治療帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。中醫(yī)藥以其獨特的診療理論和方法在抗腫瘤治療方面顯示出巨大潛力。雷公藤是臨床最為有效且運用最為廣泛的中藥之一,但其治療窗較窄,課題組很早開始關(guān)注與雷公藤具有一定親緣性的,功效接近的,但毒性相對溫和的中藥南蛇藤。南蛇藤(Celastrus orbiculatusThunb.)為衛(wèi)矛科植物南蛇藤的藤莖,始載于清代《植物名實圖考》,又名過山楓,具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)止痛、活血解毒等傳統(tǒng)功效。課題組前期發(fā)現(xiàn)南蛇藤乙酸乙酯提取物是其體內(nèi)外抗腫瘤與抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性的有效部位[1-4]。進一步通過活性追蹤、化學(xué)分離與結(jié)構(gòu)鑒定,課題組從該部位富集獲得以五環(huán)三萜為主的南蛇藤多萜(the total terpenoids ofCelastrus orbiculatusThunb.,TTC)[5]。本研究觀察了TTC對臨床一線化療藥物的體外增效作用,并采用定量藥理學(xué)模型進行評價,為南蛇藤在腫瘤治療方面的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

        1 實驗材料

        1.1 細胞株 A549與H1299人非小細胞肺癌細胞株,購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫,用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

        1.2 藥物 南蛇藤多萜:南蛇藤購自廣州致信藥業(yè),經(jīng)中國藥科大學(xué)中藥資源研究室秦民堅教授鑒定為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物南蛇藤的藤莖。取南蛇藤莖藥材10kg,加6倍量90%乙醇,浸泡1h,回流提取3次,每次2h,合并提取液,減壓回收乙醇得浸膏(0.9kg),加水混懸,用石油醚萃取3次,再用乙酸乙酯萃取3次,分離乙酸乙酯層,加20%乙醇洗滌3次后將乙酸乙酯層減壓濃縮干燥,獲得南蛇藤多萜總部位220g。以乙酰齊墩果酸進行含量測定,其中獲得二萜、三萜含量達71.2%(TTC制備工藝已獲授權(quán)發(fā)明專利:200710025343.3)。TTC儲存于4℃冰箱,臨用前用DMSO溶解成100mg/mL的儲液,用不含酚紅的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基稀釋成實驗濃度。紫杉醇注射液(福王):購自揚子江藥業(yè)集團有限公司。注射用鹽酸吉西他濱(澤菲):購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司。注射用奧沙利鉑(艾恒):購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。氟尿嘧啶注射液:購自天津金耀氨基酸有限公司。以上4種化療藥物用PBS稀釋成100mg/mL的儲液。

        1.3 主要儀器與試劑 精密天平,純水儀,倒置顯微鏡(Olympus,日本),EnspireTM多模式微孔板檢測系統(tǒng)(PerkinElmer,美國),96孔細胞培養(yǎng)板(Nunc,美國),RPMI-1640培 養(yǎng) 基 與FBS(Gibco,美國),二甲基亞砜(DMSO)與3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT購自美國Sigma公司)。

        2 實驗方法

        2.1 MTT法測定TTC單獨或與化療藥物聯(lián)合用藥的細胞毒作用 將A549、H1299細胞以每孔1×104個細胞接種在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi),加入不同濃度TTC(12.5,25,50,100,200μg/mL)或化療藥物(0.01,0.1,1,10,100μg/mL)或溶劑對照(DMSO),或分別聯(lián)合使用TTC與各化療藥物,處理48h后,每孔加入5mg/mL的MTT試劑20μL,37℃孵育4h后,小心吸棄上清,加入150μL/well DSMO溶解,酶標儀測定490nm吸光度,并計算相對細胞活力。

        2.2 Combenefit定量藥理學(xué)軟件評價TTC與化療藥物的聯(lián)用效果 采用英國癌癥研究中心劍橋研究所開發(fā)的Combenefit定量藥理學(xué)軟件及Loewe相加模型評價2種化合物組合后潛在的藥物相互作用[6]。測試時,2種藥物的5種梯度濃度包括溶劑對照孔以矩陣模式混合。通過MTT測定每孔細胞的相對增長率所得響應(yīng)值通過Combenefit軟件使用以生成劑量-效應(yīng)(D-R)響應(yīng)矩陣以及協(xié)同分布矩陣,并導(dǎo)出可視化結(jié)果。

        3 實驗結(jié)果

        3.1 TTC與4種化療藥物聯(lián)合用藥劑量確定 為了確定聯(lián)合用藥采用的劑量范圍,實驗首先研究了TTC與4種化療藥物單獨使用對A549與H1299兩種非小細胞肺癌細胞株的生長抑制活性,并采用作圖軟件GraphPad自帶的Logistic非線性回歸方程擬合量效關(guān)系曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTC與4種化療藥物處理細胞48h后分別在12.5~200μg/mL與0.01~100μg/mL劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)典型的劑量依賴關(guān)系,其半數(shù)抑制濃度IC50值也基本分布在試驗劑量范圍的中間,此時IC50數(shù)據(jù)計算相對精確(見圖1)。因此,在聯(lián)合用藥時,采用低于TTC自身IC50劑量(3.125,6.25,12.5,25,50μg/mL)與較寬范圍的化療藥物給藥劑量(0.01,0.1,1,10,100μg/mL)進行聯(lián)合給藥,觀察低劑量TTC與化療藥物是否存在增敏作用,以及所增敏的化療藥物的劑量區(qū)間。

        圖1 TTC與4種化療藥物單獨給藥對非小細胞肺癌細胞株體外增殖的影響

        圖2 TTC與4種化療藥物聯(lián)合給藥對A549(A)與H1299(B)細胞體外增殖的影響

        3.2 TTC與4種化療藥物聯(lián)合用藥效果分析 聯(lián)合用藥時,將5個梯度TTC劑量(3.125,6.25,12.5,25,50μg/mL)與5個梯度化療藥物(0.01,0.1,1,10,100μg/mL)連同溶劑對照(即0μg/mL)以矩陣混合的方式進行給藥,因此共產(chǎn)生36種劑量組合。從Combenefit軟件生成的兩株細胞對聯(lián)合用藥的響應(yīng)矩陣圖可以看出,聯(lián)合用藥的量效關(guān)系呈現(xiàn)對角線分布(見圖2)。Loewe相加定量藥理學(xué)藥物相互作用擬合的結(jié)果發(fā)現(xiàn),TTC與4種化療藥物均能產(chǎn)生一定的協(xié)同作用。其中,TTC在接近IC50劑量(25~50μg/mL)下與高劑量(10~100μg/mL)的氟尿嘧啶產(chǎn)生協(xié)同,而在低于IC50劑量(3.125~25μg/mL)下與低劑量(0.01~10μg/mL)的吉西他濱、奧沙利鉑、紫杉醇產(chǎn)生一定的協(xié)同(見圖2)。因此針對后3種化療藥物,在采用低劑量的TTC對其產(chǎn)生增敏作用時,還允許使用更低的化療藥物劑量。

        4 討論

        課題組前期針對多種消化道腫瘤充分證實南蛇藤提取物體內(nèi)抗腫瘤作用的有效性和初步的安全性[1-3],因此明確南蛇藤未來在腫瘤治療中的臨床定位及能夠體現(xiàn)其作用特點的應(yīng)用價值對南蛇藤開發(fā)利用具有重要意義。我們注意到,臨床上腫瘤患者首次接觸化療藥物無效(固有性耐藥)或者接受化療一段時間內(nèi)有效但再次進展時(繼發(fā)性耐藥)通常不再接受相同藥物治療且無法采取進一步可行性措施,此時若繼續(xù)給予化療藥物治療,同時給予中藥治療,可以重新獲得化療療效,即所謂的腫瘤復(fù)敏(re-sensitization)[7]。這為腫瘤耐藥患者的后續(xù)治療生存帶來一縷曙光,也為中藥抗腫瘤治療提供新的契機。

        為了評價南蛇藤多萜能否對現(xiàn)代常規(guī)化療產(chǎn)生潛在的增效作用,本實驗采用3D可視化的定量藥理學(xué)計算軟件篩選南蛇藤多萜與化療藥物的聯(lián)合效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTC能在低于其IC50劑量下增強多種一線化療藥物的敏感性,因此在廣譜性的化療增敏劑方面有較為廣闊的應(yīng)用前景??紤]TTC本身具有一定的抗腫瘤活性,因此其化療增敏作用有可能來源于作用機制上的互補性。Combenefit軟件中的Loewe相加模型引入等效劑量的概念,建立了用等效線方法判斷藥物相互作用的指標,將藥物相互作用進行定量化[8]。利用該軟件Loewe相加模型評價并以熱圖方式呈現(xiàn)TTC與四種化療藥物的相互作用,我們發(fā)現(xiàn)這種相互作用在不同的細胞株中的效應(yīng)分布基本一致,特別是兩種藥物分別在低劑量下聯(lián)用產(chǎn)生大于同等劑量的藥理效應(yīng),即TTC對低于治療量的化療藥物產(chǎn)生增敏作用。

        在今后的工作中,我們將進一步建立符合臨床耐藥進展特點的耐藥模型,在此基礎(chǔ)上考察TTC能否實時性增強化療藥物的敏感性甚至逆轉(zhuǎn)耐藥模型并達到最初的敏感性,從而為南蛇藤作為腫瘤復(fù)敏的中藥新藥開發(fā)夯實臨床前數(shù)據(jù)。

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