陶 麗 劉延慶

（1.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225001； 2.國家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點研究室，江蘇揚州 225001）

化療是目前治療癌癥最有效的手段之一，但針對腫瘤耐藥后出現(xiàn)的疾病進展，臨床尚無替代性的良策，給癌癥治療帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。中醫(yī)藥以其獨特的診療理論和方法在抗腫瘤治療方面顯示出巨大潛力。雷公藤是臨床最為有效且運用最為廣泛的中藥之一，但其治療窗較窄，課題組很早開始關(guān)注與雷公藤具有一定親緣性的，功效接近的，但毒性相對溫和的中藥南蛇藤。南蛇藤（Celastrus orbiculatusThunb.）為衛(wèi)矛科植物南蛇藤的藤莖，始載于清代《植物名實圖考》，又名過山楓，具有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)止痛、活血解毒等傳統(tǒng)功效。課題組前期發(fā)現(xiàn)南蛇藤乙酸乙酯提取物是其體內(nèi)外抗腫瘤與抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性的有效部位[1-4]。進一步通過活性追蹤、化學(xué)分離與結(jié)構(gòu)鑒定，課題組從該部位富集獲得以五環(huán)三萜為主的南蛇藤多萜（the total terpenoids ofCelastrus orbiculatusThunb.，TTC）[5]。本研究觀察了TTC對臨床一線化療藥物的體外增效作用，并采用定量藥理學(xué)模型進行評價，為南蛇藤在腫瘤治療方面的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 細胞株 A549與H1299人非小細胞肺癌細胞株，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 藥物 南蛇藤多萜：南蛇藤購自廣州致信藥業(yè)，經(jīng)中國藥科大學(xué)中藥資源研究室秦民堅教授鑒定為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物南蛇藤的藤莖。取南蛇藤莖藥材10kg，加6倍量90%乙醇，浸泡1h，回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓回收乙醇得浸膏（0.9kg），加水混懸，用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分離乙酸乙酯層，加20%乙醇洗滌3次后將乙酸乙酯層減壓濃縮干燥，獲得南蛇藤多萜總部位220g。以乙酰齊墩果酸進行含量測定，其中獲得二萜、三萜含量達71.2%（TTC制備工藝已獲授權(quán)發(fā)明專利：200710025343.3）。TTC儲存于4℃冰箱，臨用前用DMSO溶解成100mg/mL的儲液，用不含酚紅的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基稀釋成實驗濃度。紫杉醇注射液（福王）：購自揚子江藥業(yè)集團有限公司。注射用鹽酸吉西他濱（澤菲）：購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司。注射用奧沙利鉑（艾恒）：購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。氟尿嘧啶注射液：購自天津金耀氨基酸有限公司。以上4種化療藥物用PBS稀釋成100mg/mL的儲液。

1.3 主要儀器與試劑 精密天平，純水儀，倒置顯微鏡（Olympus，日本），EnspireTM多模式微孔板檢測系統(tǒng)（PerkinElmer，美國），96孔細胞培養(yǎng)板（Nunc，美國），RPMI-1640培 養(yǎng) 基 與FBS（Gibco，美國），二甲基亞砜（DMSO）與3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT購自美國Sigma公司）。

2 實驗方法

2.1 MTT法測定TTC單獨或與化療藥物聯(lián)合用藥的細胞毒作用 將A549、H1299細胞以每孔1×104個細胞接種在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入不同濃度TTC（12.5，25，50，100，200μg/mL）或化療藥物（0.01，0.1，1，10，100μg/mL）或溶劑對照（DMSO），或分別聯(lián)合使用TTC與各化療藥物，處理48h后，每孔加入5mg/mL的MTT試劑20μL，37℃孵育4h后，小心吸棄上清，加入150μL/well DSMO溶解，酶標儀測定490nm吸光度，并計算相對細胞活力。

2.2 Combenefit定量藥理學(xué)軟件評價TTC與化療藥物的聯(lián)用效果 采用英國癌癥研究中心劍橋研究所開發(fā)的Combenefit定量藥理學(xué)軟件及Loewe相加模型評價2種化合物組合后潛在的藥物相互作用[6]。測試時，2種藥物的5種梯度濃度包括溶劑對照孔以矩陣模式混合。通過MTT測定每孔細胞的相對增長率所得響應(yīng)值通過Combenefit軟件使用以生成劑量-效應(yīng)（D-R）響應(yīng)矩陣以及協(xié)同分布矩陣，并導(dǎo)出可視化結(jié)果。

3 實驗結(jié)果

3.1 TTC與4種化療藥物聯(lián)合用藥劑量確定 為了確定聯(lián)合用藥采用的劑量范圍，實驗首先研究了TTC與4種化療藥物單獨使用對A549與H1299兩種非小細胞肺癌細胞株的生長抑制活性，并采用作圖軟件GraphPad自帶的Logistic非線性回歸方程擬合量效關(guān)系曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTC與4種化療藥物處理細胞48h后分別在12.5～200μg/mL與0.01～100μg/mL劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)典型的劑量依賴關(guān)系，其半數(shù)抑制濃度IC50值也基本分布在試驗劑量范圍的中間，此時IC50數(shù)據(jù)計算相對精確（見圖1）。因此，在聯(lián)合用藥時，采用低于TTC自身IC50劑量（3.125，6.25，12.5，25，50μg/mL）與較寬范圍的化療藥物給藥劑量（0.01，0.1，1，10，100μg/mL）進行聯(lián)合給藥，觀察低劑量TTC與化療藥物是否存在增敏作用，以及所增敏的化療藥物的劑量區(qū)間。

圖1 TTC與4種化療藥物單獨給藥對非小細胞肺癌細胞株體外增殖的影響

圖2 TTC與4種化療藥物聯(lián)合給藥對A549（A）與H1299（B）細胞體外增殖的影響

3.2 TTC與4種化療藥物聯(lián)合用藥效果分析 聯(lián)合用藥時，將5個梯度TTC劑量（3.125，6.25，12.5，25，50μg/mL）與5個梯度化療藥物（0.01，0.1，1，10，100μg/mL）連同溶劑對照（即0μg/mL）以矩陣混合的方式進行給藥，因此共產(chǎn)生36種劑量組合。從Combenefit軟件生成的兩株細胞對聯(lián)合用藥的響應(yīng)矩陣圖可以看出，聯(lián)合用藥的量效關(guān)系呈現(xiàn)對角線分布（見圖2）。Loewe相加定量藥理學(xué)藥物相互作用擬合的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TTC與4種化療藥物均能產(chǎn)生一定的協(xié)同作用。其中，TTC在接近IC50劑量（25～50μg/mL）下與高劑量（10～100μg/mL）的氟尿嘧啶產(chǎn)生協(xié)同，而在低于IC50劑量（3.125～25μg/mL）下與低劑量（0.01～10μg/mL）的吉西他濱、奧沙利鉑、紫杉醇產(chǎn)生一定的協(xié)同（見圖2）。因此針對后3種化療藥物，在采用低劑量的TTC對其產(chǎn)生增敏作用時，還允許使用更低的化療藥物劑量。

4 討論

課題組前期針對多種消化道腫瘤充分證實南蛇藤提取物體內(nèi)抗腫瘤作用的有效性和初步的安全性[1-3]，因此明確南蛇藤未來在腫瘤治療中的臨床定位及能夠體現(xiàn)其作用特點的應(yīng)用價值對南蛇藤開發(fā)利用具有重要意義。我們注意到，臨床上腫瘤患者首次接觸化療藥物無效（固有性耐藥）或者接受化療一段時間內(nèi)有效但再次進展時（繼發(fā)性耐藥）通常不再接受相同藥物治療且無法采取進一步可行性措施，此時若繼續(xù)給予化療藥物治療，同時給予中藥治療，可以重新獲得化療療效，即所謂的腫瘤復(fù)敏（re-sensitization）[7]。這為腫瘤耐藥患者的后續(xù)治療生存帶來一縷曙光，也為中藥抗腫瘤治療提供新的契機。

為了評價南蛇藤多萜能否對現(xiàn)代常規(guī)化療產(chǎn)生潛在的增效作用，本實驗采用3D可視化的定量藥理學(xué)計算軟件篩選南蛇藤多萜與化療藥物的聯(lián)合效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTC能在低于其IC50劑量下增強多種一線化療藥物的敏感性，因此在廣譜性的化療增敏劑方面有較為廣闊的應(yīng)用前景?？紤]TTC本身具有一定的抗腫瘤活性，因此其化療增敏作用有可能來源于作用機制上的互補性。Combenefit軟件中的Loewe相加模型引入等效劑量的概念，建立了用等效線方法判斷藥物相互作用的指標，將藥物相互作用進行定量化[8]。利用該軟件Loewe相加模型評價并以熱圖方式呈現(xiàn)TTC與四種化療藥物的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)這種相互作用在不同的細胞株中的效應(yīng)分布基本一致，特別是兩種藥物分別在低劑量下聯(lián)用產(chǎn)生大于同等劑量的藥理效應(yīng)，即TTC對低于治療量的化療藥物產(chǎn)生增敏作用。

在今后的工作中，我們將進一步建立符合臨床耐藥進展特點的耐藥模型，在此基礎(chǔ)上考察TTC能否實時性增強化療藥物的敏感性甚至逆轉(zhuǎn)耐藥模型并達到最初的敏感性，從而為南蛇藤作為腫瘤復(fù)敏的中藥新藥開發(fā)夯實臨床前數(shù)據(jù)。