何盾，吳芳蘭，徐曉芃，廖陽英，馮浩

（1.湖南省常德市第一人民醫(yī)院 皮膚科，湖南 常德 415000；2.長沙市第一醫(yī)院 檢驗科，湖南 長沙 410005；3.湖南省人民醫(yī)院 皮膚科，湖南 長沙 410005）

黃褐斑是一種臨床常見的色素沉著性皮膚病，臨床療效欠佳，因好發(fā)于面部，臨床研究中取材困難，對治療結果的判斷比較主觀。熊果苷含有美白成分，目前臨床多用于美白。本研究復制熊果苷治療黃褐斑鼠模型，以探討其療效及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雌性純白豚鼠 50 只，體重（230±30）g，購自并飼養(yǎng)于湖南師范大學第一附屬醫(yī)院動物實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2015-0013。

1.1.2 實驗藥品 熊果苷軟膏購自上海新先鋒藥業(yè)有限公司，黃體酮（20 mg/ml）購自上海通用藥業(yè)股份有限公司，用滅菌注射用水稀釋。

1.1.3 實驗試劑及儀器 硫化鈉Na2S購自濟寧百川化工有限公司，酪氨酸、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，HMB45即用型試劑盒購自上海Dako公司。DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機購自寧波新蘭生物科技股份有限公司，Olympus系統(tǒng)生物顯微鏡（Image-Pro Plus 6.0）購自美國Media Cybernetics公司。

1.2 方法

1.2.1 模型復制 參照文獻 [1-2]，以 7.5 mg/kg（相當于人用臨床劑量的3倍）肌內(nèi)注射20 mg/ml黃體酮注射液1次，于豚鼠后腿根部連續(xù)注射30 d。豚鼠背部模型區(qū)域皮膚呈均一穩(wěn)定、邊界清晰的深褐色色斑，HMB45標記的黑色素陽性細胞明顯增多，呈強陽性反應，表皮基底細胞和棘細胞層中可見單個散在黑色素細胞為模型復制成功。

1.2.2 分組及給藥[3]將50只豚鼠按體重隨機分為5組，分別為空白組、模型組、熊果苷軟膏低劑量治療組（0.125 g/100 g）（低劑量組）、中劑量治療組（0.250 g/100 g）（中劑量組）和高劑量治療組（0.500 g/100 g）（高劑量組）。空白組按5 ml/kg肌內(nèi)注射滅菌注射用水，其余4組均復制模型。實驗前24 h將脊柱兩側及靠臀部皮膚用Na2S脫毛4 cm×4 cm，每周脫毛1次。熊果苷軟膏治療組模型復制成功當天分別按比例計算局部涂擦藥物，1次/d，連續(xù)用藥30 d。空白組和模型組則予以蒸餾水局部涂抹，1次/d，時間和療程同熊果苷軟膏治療組。于末次給藥1天后處死所有豚鼠，每只豚鼠于脫毛處迅速取皮膚組織2塊備用。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 酪氨酸、MDA含量，SOD活性測定[4-5]所有豚鼠取備用皮膚組織1塊用預冷生理鹽水沖洗，除去皮下脂肪及其他結締組織后拭干，每塊皮膚組織各切取0.5 g，再分別放入盛有2.0 ml預冷生理鹽水的5根小試管內(nèi)，高速分散機以10 r/min的速度勻漿，持續(xù)10 s，重復1次，再以3 500 r/m速度離心15 min，取上清液。酪氨酸測定采用高效液相法，MDA測定用硫代巴比妥酸法，SOD測定用黃嘌呤氧化酶法，按試劑盒說明書檢測酪氨酸、MDA含量及SOD活性。

1.3.2 皮膚黑色素細胞的病理形態(tài)學觀察 所有豚鼠取備用皮膚組織1塊，約2 cm×1 cm，10%多聚甲醛固定，病理組織檢測，免疫組織化學染色，觀察黑色素細胞染色和數(shù)目，并根據(jù)文獻[4]判斷陽性細胞：無，0分；＜15%，0.5分；＜30%，1分；＞30%，2分。每張切片分別觀察5個視野，找到皮膚表皮和附件上皮細胞胞漿中呈現(xiàn)棕色反應的陽性目標后，用BX50F4北航病理圖像分析系統(tǒng)定量分析，得到每只豚鼠5個視野黑色素陽性目標的平均面積、目標與統(tǒng)計場面積之比（面密度）、目標個數(shù)與統(tǒng)計場面積之比（數(shù)密度）、平均灰度、平均光密度及積分光密度。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性

各組豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組豚鼠皮膚酪氨酸、MDA含量均高于空白組，SOD活性低于空白組；與模型組比較，熊果苷軟膏治療組皮膚酪氨酸、MDA含量較低，中劑量組最低；而SOD活性則升高，中劑量組最高。見表1。

2.2 各組豚鼠黑色素細胞的面積、數(shù)量及深淺度比較

各組黑色素細胞面積、數(shù)量及深淺度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表 2、3）；由圖 1、2 可見，與空白組比較，模型組豚鼠皮膚黑色素沉著面積增大、黑色素細胞個數(shù)增多，光密度變大，著色變深；與模型組比較，熊果苷軟膏治療組豚鼠皮膚，黑色素沉著面積縮小、黑色素細胞個數(shù)減少，光密度變小，著色變淺，以中劑量組為最明顯。

表1 各組豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性比較（n =10，±s）

表1 各組豚鼠酪氨酸、MDA含量及SOD活性比較（n =10，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 酪氨酸/μg MDA/（nmol，ml） SOD/（NU/ml）空白組 0.43±0.04 10.16±2.06 105.82±15.76模型組 0.68±0.06 13.30±0.97 89.11±6.71低劑量組 0.47±0.131）2） 12.04±1.791）2） 101.06±13.661）2）中劑量組 0.45±0.091）2） 11.40±0.971）2） 103.29±11.221）2）高劑量組 0.49±0.191）2） 11.75±1.791）2） 101.63±13.181）2）F值 7.129 5.449 2.676 P值 0.000 0.001 0.044

表2 各組豚鼠黑色素細胞面積、數(shù)量比較（n =10，±s）

表2 各組豚鼠黑色素細胞面積、數(shù)量比較（n =10，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 面積/μm2 面密度 個數(shù) 數(shù)密度空白組 325.27± 48.68 0.004±0.001 1.12±0.28 1.69±0.92模型組 2 364.81±617.88 0.011±0.004 3.19±1.64 5.47±1.80低劑量組 557.16±144.541）2） 0.005±0.0021）2） 2.52±0.911）2） 2.07±0.871）2）中劑量組 381.65± 55.001）2） 0.004±0.0021）2） 1.91±0.681）2） 1.91±1.041）2）高劑量組 541.52±124.821）2） 0.005±0.0011）2） 2.31±0.501）2） 1.98±1.811）2）F值 87.601 15.623 6.805 19.323 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 各組豚鼠黑色素細胞深淺度的比較（n =10，±s）

表3 各組豚鼠黑色素細胞深淺度的比較（n =10，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 平均灰度 平均光密度 積分光密度空白組 111.45±10.79 0.29±0.05 225.19±84.55模型組 86.29±12.02 0.59±0.16 715.90±257.60低劑量組 100.66±11.941）2） 0.34±0.081）2） 395.27±124.721）2）中劑量組 105.22±11.661）2） 0.31±0.081）2） 300.92± 91.871）2）高劑量組 104.08±7.531）2） 0.33±0.081）2） 370.62±119.501）2）F值 7.361 16.201 15.772 P值 0.000 0.000 0.000

圖1 黃褐斑鼠模型及治療前免疫組織化學染色結果

圖2 各組豚鼠治療后HMB45免疫組織化學染色結果（×400）

3 討論

黃褐斑是一種好發(fā)于中、青年女性的獲得性色素障礙性疾病，其發(fā)病機制極為復雜，影響因素眾多，可能與飲食、內(nèi)分泌失調(diào)、妊娠、化妝品使用、日光照射、精神因素及避孕藥等諸多因素相關[6]。

各種原因所致的皮膚黑色素的沉積，是黃褐斑表現(xiàn)的直接原因。黑色素是酪氨酸酶一系列氧化反應后生成。酪氨酸在酪氨酸酶的氧化作用下，在黑素小體內(nèi)被氧化成多巴，多巴進一步被多巴氧化酶氧化成多巴醌，多巴醌最終在酪氨酸酶的氧化下形成黑色素。由此可見，該過程中一系列的氧化與抗氧化反應紊亂，都可能造成黃褐斑的發(fā)生、發(fā)展，而酪氨酸的增多則是黃褐斑發(fā)病的主要物質(zhì)基礎。當這一系列氧化反應平衡紊亂時，體內(nèi)將過量生成氧自由基，并且造成SOD等抗氧化酶活性降低，造成膜脂質(zhì)過氧化，形成過氧化脂質(zhì)（LPO），LPO不穩(wěn)定，迅速分解，產(chǎn)生醛類，其終產(chǎn)物——MDA相應隨之增多，并迅速攻擊磷脂及蛋白質(zhì)，導致色素細胞的氧化性損傷，因而也促進了酪氨酸酶的氧化反應，使得黑色素增多，并于皮膚基底層顯著堆積，此即為黃褐斑等色素性皮膚疾病的發(fā)病機制之一。故而，降低皮膚組織MDA含量，提高抗氧化酶SOD活性，對黃褐斑的預防及治療有著重要意義。熊果苷提取于熊果葉，其抑制酪氨酸酶活性而達到美白效果，現(xiàn)幾乎壟斷美白市場。它主要通過阻斷多巴及多巴醌的合成，從而有效抑制黑色素的生長，以達到去除色斑的效果。有研究證實[7]，熊果苷是一種理想的脫色素藥物，雖然抑制酪氨酸酶活性，但不影響酪氨酸酶的表達和合成。其脫色機制主要是在轉錄后階段抑制酪氨酸酶的活性，對黑素細胞酪氨酸酶家族的3種酶的含量及分子大小均無改變[8]。熊果苷包括α-熊果苷和β-熊果苷。有文獻報道[9-11]，α-熊果苷比β-熊果苷美白作用強10倍，無毒副作用，高濃度對人體細胞生長無抑制作用，對紫外線灼傷導致瘢痕效果明顯。氫醌是最早并最廣泛應用的美白劑，但因皮膚色素分布不均及刺激性較強，甚至可能致癌等原因，在美白甚至黃褐斑的治療中已被限制應用。相比而言，熊果苷美白效果佳，毒副作用小，是目前臨床應用最為廣泛的美白劑之一，能有效抑制黑色素地生長[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組皮膚酪氨酸、MDA含量升高，SOD含量降低。而模型組皮膚病理形態(tài)學觀察顯示黑色素沉著面積增大且色深。光密度反映物質(zhì)對光吸收的多少，顏色越深，目標面積越大，則光密度值越高。熊果苷軟膏治療組皮膚酪氨酸、MDA含量降低，SOD含量升高，而低、中、高3種劑量治療組中，豚鼠模型皮膚病理形態(tài)學觀察顯示黑色素沉著面積縮小、著色變淺，尤以中劑量組最為突出，說明熊果苷能有效抑制黑色素的生成，從而達到治療黃褐斑的效果，而不同濃度的熊果苷治療效果間有差異，本實驗證明中等劑量（0.250 g/100 g）治療效果相對明顯，有研究[13]將熊果苷配制為10、50、100、500、1 000 μmol/L并與黑素細胞同時培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)50 μmol/L濃度的熊果苷對酪氨酸酶活性和黑色素抑制作用最為明顯，與本研究結果一致，可能是因為熊果苷通過抑制酪氨酸酶活性起作用，濃度低時未完全抑制所有酶的活性，濃度高時因活性抑制已達到飽和狀態(tài)，因而無明顯變化，而中等劑量比較合適。

綜上所述，熊果苷軟膏主要成分是熊果苷，經(jīng)實驗證明它有效的增白作用，可能通過提高局部皮膚組織中SOD酶活性，明顯降低酪氨酸、MDA的含量，而抑制黑色素細胞和黑色素瘤細胞的酪氨酸酶活性，從而促使皮膚細胞的氧化還原反應，減少自由基產(chǎn)生，抑制黑色素的形成，進而有效治療黃褐斑，熊果苷是一種安全、有效、毒副作用小的美白劑。