陳紅，李鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

鶴類屬于鳥綱、鶴形目、鶴科，是世界上珍稀的涉禽鳥類[1]。由于鶴類種群小而分散，繁殖速度緩慢，對狩獵壓力和化學(xué)污染反應(yīng)脆弱，從而造成鶴類數(shù)量急劇銳減，全世界現(xiàn)存15種，已有7種被列為瀕危動物[2]。而我國現(xiàn)存鶴類僅存9種[1]。全面深入的了解鶴類系統(tǒng)發(fā)生和基因組的進(jìn)化將為鶴類的保護(hù)工作打開全新的局面，對鶴類的保護(hù)和研究具有重要意義。但有關(guān)鶴類種群遺傳多樣性的研究鮮有報道。

與RAPD[3]技術(shù)一樣，單核苷酸多態(tài)性分析是構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的重要方法[4]。細(xì)胞核基因的內(nèi)含子是普遍存在的，并且相鄰的外顯子的核苷酸序列是保守的，能獨立快速發(fā)展的DNA，內(nèi)含子序列的研究成為動物分子系統(tǒng)學(xué)的基礎(chǔ)[5]。β-纖維蛋白原第7內(nèi)含子是一個富含AT的內(nèi)含子，其堿基組成的變化代表著鳥類的進(jìn)化[6]。β-纖維蛋白原核苷酸的多態(tài)性檢測曾被用于貓科[7]等哺乳動物[8]及某些鳥類[6，9]的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。本文以三種鶴類為研究對象，以火烈鳥為對照，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及測序?qū)嶒灒治靓?纖維蛋白原第七內(nèi)含子的核苷酸多態(tài)性，從DNA水平來探討三種鶴類之間的親緣關(guān)系，尋找適合鶴科鳥類的系統(tǒng)分類指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 材料來源

2～3歲齡雄性四種涉禽鳥類新鮮血液，采自哈爾濱 動 物 園 灰 鶴 （Grus grus）、 丹 頂 鶴（Grus japonensis）、 白 鶴 （Grus leucogeranus）、 火 烈 鳥（Phoenico pterus ruber）。

1.2 主要試劑

Taq Plus DNA Polymerase（購自天根生化科技（北京）有限公司）；全血基因組DNA快速提取試劑盒（購自原平皓（天津）生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒I（離心柱型）（北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司）18-T Vector（寶生物工程（大連）有限公司）；質(zhì)粒DNA小量快速制備試劑盒（杭州博日生物技術(shù)公司）等。

1.3 全血基因組DNA快速提取

取30 μL新鮮加入抗凝劑的血液，放入1.5 mL離心管。按照全血基因組DNA快速提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA。所得DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢驗，-20℃保存。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

根據(jù)Genbank中的Grus leucogeranus betafibrinogen gene，intron 7（索引號：DQ494146） 應(yīng)用primer5.0軟件設(shè)計引物，其序列如表1，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列和產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequences and product length

用PCR儀擴增，94℃變性，55℃退火，72℃延伸，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，按照瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒操作方法純化目的基因。

1.5 PCR產(chǎn)物克隆及序列測定

將PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體中，篩選陽性克隆，由生工生物工程（上海）股份有限公司對目的片段測序。

2 實驗結(jié)果

2.1 β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因擴增結(jié)果

通過PCR方法擴增β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因，經(jīng)1.2%的瓊脂糖電泳。結(jié)果表明（見圖1），目的條帶特異、清晰，與實驗設(shè)計目的片段大小一致（565 bp）。

2.2 β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因片段序列分析

β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因克隆產(chǎn)物測序結(jié)果為：灰鶴 （Grusgrus）565 bp、丹頂鶴（Grus japonensis）566 bp、白鶴（Grus leucogeranus）565 bp、火烈鳥（Phoenico pterus ruber）562 bp。測序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行比對（圖2）。由圖可知，三種鶴類β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因序列中第23、44、116、189位核苷酸為多態(tài)性位點。

圖1 四種涉禽β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 The PCR amplification products for intron of β-fibrinogen gene of four waders

圖2 四種涉禽β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因序列比對分析Fig.2 Comparation analysis for intron 7 of β-fibrinogen gene of four waders

2.3 β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因片段序列相似系數(shù)和遺傳距離分析

四種涉禽β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子核苷酸序列分析結(jié)果（圖3）。丹頂鶴與灰鶴核苷酸相似度最高，距離最近；火烈鳥與灰鶴核苷酸相似度最低，距離最遠(yuǎn)。

圖3 四種涉禽β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子核苷酸序列相似系數(shù)和遺傳距離分析Fig.3 Similarity coefficient and genetic distance analysis for intron 7 of β-fibrinogen gene of four waders

2.4 β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因序列聚類分析

利用DNAStar軟件對三種鶴類和火烈鳥的β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因序列進(jìn)行聚類分析，用距離法構(gòu)建進(jìn)化樹，推演β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系（圖4）。丹頂鶴與灰鶴親緣關(guān)系最近，遺傳距離系數(shù)為0.08；火烈鳥與鶴類親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，遺傳距離系數(shù)為0.972。

圖4 四種涉禽β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因序列聚類關(guān)系Fig.4 Clustering relationship analysis for intron 7 of β-fibrinogen gene between four waders

3 討論

本實驗檢測了三種鶴類和火烈鳥的β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子基因序列，并進(jìn)行了序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明三種鶴類β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子核苷酸序列距離在0.4以內(nèi)，其中丹頂鶴和灰鶴基因序列相似性最高為99.8%，親緣關(guān)系最近，遺傳距離系數(shù)為0.08；與葛運生、陳亮等[8]2004年報道的實驗結(jié)果一致?；鹆银B與鶴類親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離系數(shù)為0.972。其中白鶴與火烈鳥基因序列相似性為91.2%；丹頂鶴與火烈鳥基因相似性為91.0%；灰鶴與火烈鳥基因相似性最低為90.8%。這些為鶴類的系統(tǒng)進(jìn)化分析提供了重要實驗數(shù)據(jù)。

由于β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子具有較高的屬種保守性，其序列的缺失和置換在解決親緣關(guān)系較近的分類階元的系統(tǒng)關(guān)系方面具有重要價值。鶴類的β-纖維蛋白原第七內(nèi)含子的核苷酸多態(tài)性，主要發(fā)生缺失和顛換（圖2），這與相關(guān)的系統(tǒng)發(fā)育樹和基因組進(jìn)化分析中的結(jié)果一致[9]。與利用線粒體[10]進(jìn)行親緣關(guān)系分析一樣，β-纖維蛋白原核苷酸序列的缺失和替換是構(gòu)建鶴科鳥類分子進(jìn)化樹和鑒定親緣關(guān)系的一個有效方法。

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