劉姍，高玉榮

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的肽或前體，通常認(rèn)為它只作用于與產(chǎn)生菌同種的其他菌株或與其親緣關(guān)系很近的物種[1]。鑒于乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素具備高效、體內(nèi)無殘留、無抗藥性及不污染環(huán)境等特點(diǎn)，近年來被推薦作為生物型的防腐劑用于食品的保藏當(dāng)中[2]。目前只有Nisin[3]和pediocin PA-1/AcH 在工業(yè)中有應(yīng)用，但由于這些細(xì)菌素只對大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌有抑制作用，但對革蘭氏陰性細(xì)菌無作用，而且在酸性環(huán)境下不穩(wěn)定，這使得目前乳酸菌細(xì)菌素的應(yīng)用范圍較窄，限制了其在食品中的應(yīng)用[4]。因此開發(fā)新型廣譜、抗菌活性強(qiáng)，穩(wěn)定性強(qiáng)的乳酸菌細(xì)菌素已成為目前的發(fā)展趨勢。在前期實(shí)驗(yàn)中已從發(fā)酵酸黃瓜中篩選出了一株產(chǎn)新型廣譜細(xì)菌素的Lactococcus garvieae LG34，并對其產(chǎn)生的格氏乳球菌素LG34 進(jìn)行了分離純化。對其抑菌譜及溫度、酶、酸堿、無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑、表面活性劑對其生物穩(wěn)定性的影響進(jìn)行了研究，為其在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

Lactococcus garvieae LG34：從發(fā)酵酸黃瓜中篩選得到一株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的乳酸菌。

抑菌譜所用菌（見表1）：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，K2HPO4·3H22 g，乙酸鈉5 g，CaCO35 g，檸檬酸三銨2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，吐溫-80 1 mL，pH 6.5。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，pH7.2～7.4。

指示菌上層培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨8 g，瓊脂0.8 g，pH 值為7.4～7.6。

指示菌下層培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨8 g，瓊脂1.5 g，pH 值為7.4～7.6。

1.3 細(xì)菌素樣品的制備

將保存在MRS 斜面培養(yǎng)基的Lactococcus garvieae LG34 挑取1～2 環(huán)轉(zhuǎn)接到10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，于30 ℃靜置培養(yǎng)16～18 h，按2%～3%擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液在4 000 r·min-1下離心20 min，將無細(xì)胞上清液調(diào)pH 至6.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮10 倍。加入4 倍體積預(yù)冷至-20 ℃無水乙醇過夜沉淀，再將濃縮液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮2 倍。

1.4 格氏乳球菌素LG34 抗菌譜測定

分別選取G+、G-、霉菌、酵母菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法測定格氏乳球菌素的抑菌效果。

1.5 溫度、蛋白酶及pH 對格氏乳球菌素LG34 的影響

將格氏乳球菌素LG34 在80、90、100 ℃分別處理30 min 和60 min，121 ℃處理30 min 后，以未經(jīng)熱處理的作為對照，測定熱處理后的格氏乳球菌素LG34 對金黃葡萄球菌的抑菌活性。

將胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別溶解在20 mmol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.6、pH 2.0、pH 6.2、pH 7.0、pH 7.0）中配成酶母液，分別加入格氏乳球菌素LG34 提取液，使酶終濃度為5 mg·mL-1，在37 ℃水浴中溫浴5 h，取出后將pH 調(diào)到6.0，以金黃色葡萄球菌為指示菌，用瓊脂擴(kuò)散法檢測抑菌活性，以未加酶處理的樣品作為對照，檢測各種蛋白酶對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

將格氏乳球菌素LG34 樣品的pH 值用1 mol·L-1NaOH 和1 mol·L-1HCl 分別調(diào)整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，經(jīng)12 h 作用后將pH 值調(diào)至6.0，以未處理的細(xì)菌素樣品為空白對照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，測定pH 對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

1.6 無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑及表面活性劑對格氏乳球菌素LG34 的影響

分別將0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mol·L-1的NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、CuSO4加入格氏乳球菌素LG34 粗提液中，搖勻后靜置4 h，采用瓊脂擴(kuò)散法測定無機(jī)鹽對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

將10%、20%、30%、40%、50%體積的氯仿、丙酮、乙醚、甲苯、異丙酮加入格氏乳球菌素LG34 粗提液中，搖勻后靜置4 h，測定有機(jī)溶劑對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

分別將10%、20%、30%、40%、50%體積的甘油、吐溫-80 加入格氏乳球菌素LG34 粗提液中，搖勻后靜置4 h，測定表面活性劑對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌素抑菌譜的測定

由表1 可見，格氏乳球菌LG34 的抑菌譜較廣，除枯草芽孢桿菌外，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌均有抑制作用，而且對革蘭氏陰性菌也有抑制作用，但不抑制霉菌和酵母菌。

2.2 溫度對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響

由圖1 可以看出，格氏乳球菌素LG34 對熱很穩(wěn)定，在經(jīng)121 ℃處理30 min 后抑菌活性僅降低了10.5%。敖靈[5]研究的戊糖乳桿菌C50-6 菌株產(chǎn)細(xì)菌素和單春喬等[6]研究的嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素對熱很穩(wěn)定，在121 ℃處理20 min 后仍能保持80%以上的活性。因此在食品生產(chǎn)與加工業(yè)進(jìn)行殺菌處理的過程中，不會導(dǎo)致細(xì)菌素抑菌活性的喪失。

表1 Garviecin LG34 的抑菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of garviecin LG34

圖1 溫度對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Fig.1 Effect of temperature on the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

2.3 蛋白酶對格氏乳球菌素LG34 活性的影響

表2 蛋白酶對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Table 2 Effect of enzymes to antimicrobial activity of Lactococcus garvieae LG34

由表2 可以看出，格氏乳球菌素LG34 經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后抑菌作用減弱，但并沒有消失，其中經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后的抑菌活性損失率分別為61.3%和62.9%，說明格氏乳球菌素LG34 對胃蛋白酶和胰蛋白酶具有較強(qiáng)敏感性，而對其他三種酶具有弱的敏感性。由于細(xì)菌素是一種蛋白類物質(zhì)，當(dāng)細(xì)菌素作為生物防腐劑隨食物進(jìn)入人體消化道時可被蛋白酶降解而不會在體內(nèi)殘留，具有較高的安全性。

2.4 pH 對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響

除此之外，還針對河道的化學(xué)需氧量、氨氮量以及總氮量等指標(biāo)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示各項(xiàng)指標(biāo)均明顯優(yōu)于河道治理工作開展前，說明生物生態(tài)修復(fù)治理工作在水系水體環(huán)境的治理工作中發(fā)揮出了較好的應(yīng)用效果，為提高普陀區(qū)桃浦鎮(zhèn)北環(huán)水系水體治理水平產(chǎn)生了積極影響。

圖2 pH 對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH on the antibacterial activity for Lactococcus garvieae LG34

由圖2 表明，格氏乳球菌素LG34 的抗菌活性在pH 2.0～8.0 具有較好的穩(wěn)定性，在pH 2.0 處理后活性僅損失18%，說明格氏乳球菌素LG34 具有較好的耐酸能力；在中性條件下格氏乳球菌素LG34 抑菌效果最好，但當(dāng)pH 大于9.0 后抑菌活性損失較大，在pH 值11.0 時抑菌活性最弱。國內(nèi)，李琳等[7]研究的細(xì)菌素ST9 和陳靜等[8]研究的嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素，國外Jamuna M 等[9]研究的乳酸片球菌素和Todorov等[10]研究的類細(xì)菌素，在酸性至中性條件下都具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 無機(jī)鹽對細(xì)菌素抑菌活性的影響

圖3 無機(jī)鹽對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

由圖3 可以看出，無機(jī)鹽對格氏乳球菌素LG34抑菌活性的影響顯著，抑菌活性的損失隨著無機(jī)鹽濃度的提高而增大。這5 種無機(jī)鹽對格氏乳球菌素LG34 的影響大小依次為：KCl＞CaCl2＞MgSO4＞NaCl＞CuSO4。韓誠武[11]對副干酪乳桿菌素的研究表明Na+、K+一價金屬離子對副干酪乳桿菌素活性的影響較小，而Mg2+、Ca2+二價金屬離子降低了副干酪乳桿菌素的活性。

2.6 有機(jī)溶劑對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響

由表3 可見，添加10%～50%的有機(jī)溶劑對抑菌活性的影響不顯著。通過單因素方差分析所得的P值在0.05 水平上影響差異不顯著。在李亞玲[12]的乳酸片球菌細(xì)菌素分離純化及理化性質(zhì)研究文章中結(jié)果表明有機(jī)溶劑對細(xì)菌素抑菌活性影響不顯著，與結(jié)果基本一致。

2.7 表面活性劑對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響

表3 有機(jī)溶劑加量對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Table 3 Effect of the amount of organic solvent to the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

表4 表面活性劑吐溫80 和甘油對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響Table 4 Effect of surfactant Tween 80 and glycerol to the antibacterial activity of Lactococcus garvieae LG34

由表4 可見，添加表面活性劑吐溫80、甘油后對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性的影響不顯著。

3 結(jié)論

3.1 試驗(yàn)驗(yàn)證了格氏乳球菌LG34 的抑菌譜較廣，既能抑制革蘭氏陽性菌，也能抑制革蘭氏陰性菌。

3.2 格氏乳球菌產(chǎn)細(xì)菌素LG34 具有較好的耐熱特性，在80、90 和100 ℃分別處理30 min 和60 min后，抑菌活性損失不到10%，121 ℃處理30 min 后僅損失10.5%；格氏乳球菌素LG34 對胃蛋白酶和胰蛋白酶具有較強(qiáng)敏感性，對中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶具有較弱的敏感性；格氏乳球菌素LG34具有較好的耐酸特性，pH 值在2.0～8.0 時均能保持穩(wěn)定的抑菌活性，抑菌活性損失小于20%。

3.3 KCl、NaCl、MgSO4、CaCl2、CuSO4對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性影響顯著，影響大小依次為：KCl＞CaCl2＞MgSO4＞NaCl＞CuSO4；有機(jī)溶劑甲苯、丙酮、乙醚、石油醚、氯仿及表面活性劑甘油、吐溫80 對格氏乳球菌素LG34 抑菌活性影響不顯著。

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