張爽,陳志寶,晏磊,馬星辰,趙丹
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,大慶 163319)
At. ferrooxidans 是一種以Fe2+或低價(jià)態(tài)硫作為能源生長(zhǎng)、革蘭氏染色陰性、端生鞭毛具運(yùn)動(dòng)性的化能自養(yǎng)菌[1-2]。固定化At. ferrooxidans 在酸性礦坑廢水和H2S 等廢氣的治理中具有廣泛的應(yīng)用[3]。由于游離At. ferrooxidans 在廢氣處理中存在損失量大、氣體處理量小等缺點(diǎn),目前主要開(kāi)發(fā)固定化At. ferrooxidans用于H2S 的脫除和Fe2+的再生。因此,研究At. ferrooxidans 的固定化對(duì)于H2S 的處理工藝至關(guān)重要。海藻酸鈉具有價(jià)格低廉,對(duì)細(xì)胞毒性相對(duì)較小,固定化容易成形,傳質(zhì)性能好,性質(zhì)穩(wěn)定,且對(duì)微生物細(xì)胞的富集程度高等優(yōu)點(diǎn),而成為目前應(yīng)用最廣的包埋劑之一[4]。
實(shí)驗(yàn)以At. ferrooxidans 為包埋對(duì)象,以海藻酸鈉為包埋載體,CaCl2為交聯(lián)劑,制備海藻酸鈉固定化凝膠珠??疾炝撕T逅徕c濃度、氯化鈣濃度、硝酸鈣濃度及細(xì)胞數(shù)量對(duì)Fe2+氧化率的影響,并確定最佳固定化條件。
1.1.1 菌種
At. ferrooxidans ATCC23270。
1.1.2 培養(yǎng)基
0 K 液體培養(yǎng)基[5]:(NH4)2SO43.0 g,KCl 0.1 g,K2HPO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,Ca(NO3)20.01 g,蒸餾水1 000 mL,調(diào)pH 至1.8,121 ℃滅菌15 min。
9 K 液體培養(yǎng)基[5-6]:0 K 液體培養(yǎng)基內(nèi)加入經(jīng)過(guò)濾除菌的FeSO4·7H2O(調(diào)整pH 至1.8),使Fe2+終濃度為8.9 g·L-1。
1.1.3 主要試劑和儀器
海藻酸鈉(化學(xué)純,溫州市東升化工試劑廠);Ca(NO3)2(分析純,沈陽(yáng)市華東試劑廠);CaCl2(分析純,沈陽(yáng)市華東試劑廠)。
PHSJ-3F 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)(上海雷磁儀器廠);KD-S14 電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);HZQ-C 空氣浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。
將培養(yǎng)好的At. ferrooxidans,按10%接種量分別接種到5 份盛有9 K 培養(yǎng)基的三角瓶中,恒溫30 ℃空氣震蕩培養(yǎng)48~72 h(150 rpm)。所得培養(yǎng)液1 500 rpm 離心5 min,棄去沉淀,上清液12 000 rpm離心15 min,收集細(xì)胞。去離子水溶解細(xì)胞,制得細(xì)胞懸液。
將配制好的一定濃度的海藻酸鈉40 mL 煮沸20 min,冷卻至30 ℃。加入一定濃度的細(xì)胞懸液,充分?jǐn)嚢?,待菌株與海藻酸鈉充分混合后,靜置30 min。在10 cm 高處,用9 號(hào)針頭將海藻酸鈉和At. ferrooxidans 的混合液,逐滴勻速滴入到一定濃度的交聯(lián)劑中,固定2 h,雙層紗布過(guò)濾,棄液體。pH 2.0稀硫酸反復(fù)沖洗5 次,轉(zhuǎn)至含新鮮配制的9 K 培養(yǎng)基中,恒溫30 ℃空氣震蕩培養(yǎng)72 h(150 rpm),測(cè)定Fe2+氧化率。
2.3.1 交聯(lián)劑種類及濃度對(duì)細(xì)胞固定化的影響
交聯(lián)劑選用Ca(NO3)2,設(shè)置2%、3%、4%、5%、6%五個(gè)濃度,按上述方法制備At. ferrooxidans 固定化細(xì)胞并測(cè)定其對(duì)Fe2+的氧化。交聯(lián)劑選用CaCl2,設(shè)置2%、3%、4%、5%、6%5 個(gè)濃度,按上述方法制備At. ferrooxidans 固定化細(xì)胞并測(cè)定其對(duì)Fe2+的氧化。
2.3.2 海藻酸鈉濃度對(duì)細(xì)胞固定化的影響
分別配制濃度為1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的海藻酸鈉,按上述方法制備At. ferrooxidans 固定化細(xì)胞并測(cè)定其對(duì)Fe2+的氧化。
2.3.3 At. ferrooxidans 細(xì)胞濃度對(duì)細(xì)胞固定化的影響At. ferrooxidans 細(xì)胞濃度分別設(shè)置為3×108、6×108、9×108、1.2×109及1.5×109cell·mL-1,按上述方法制備At. ferrooxidans 固定化細(xì)胞并測(cè)定其對(duì)Fe2+的氧化。
Fe2+濃度的測(cè)定采用重鉻酸鉀滴定法[7]。
Ca(NO3)2和CaCl2是兩種常用交聯(lián)劑,為了探討其對(duì)At.ferrooxidans 固定化效果,分別選取不同濃度的Ca(NO3)2和CaCl2作為交聯(lián)劑,制成At. ferrooxidans固定化細(xì)胞,以其對(duì)Fe2+的氧化率作為檢測(cè)指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知,隨著交聯(lián)劑濃度的增加,F(xiàn)e2+的氧化率逐漸減小,實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),以Ca(NO3)2為交聯(lián)劑制成的凝膠珠堅(jiān)硬,機(jī)械力強(qiáng)。CaCl2的濃度大于2%時(shí),制成的凝膠珠過(guò)于緊實(shí),使底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散相對(duì)困難。
相同濃度的CaCl2與Ca(NO3)2作交聯(lián)劑時(shí),制得的凝膠珠形狀均較好,且機(jī)械力強(qiáng),但以前者為交聯(lián)劑制得的凝膠珠對(duì)Fe2+的氧化率遠(yuǎn)大于后者。因此,后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選用的交聯(lián)劑為2%的CaCl2。
圖1 不同濃度Ca(NO3)2 和CaCl2 對(duì)Fe2+氧化率的影響Fig.1 The effect of calcium nitrate and calcium chloride with different concentrates of oxidize rate for Fe2+
選取CaCl2濃度為2%,細(xì)胞濃度為1×109,海藻酸鈉濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%進(jìn)行細(xì)胞固定化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)海藻酸鈉濃度的改變,觀察其對(duì)Fe2+的氧化情況,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可知,2.5%的海藻酸鈉對(duì)Fe2+的氧化率最高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)海藻酸鈉濃度低于2%時(shí),制得的凝膠珠形狀不規(guī)則,且較松軟,機(jī)械強(qiáng)度低,所包含的細(xì)胞數(shù)目較少;隨著海藻酸鈉濃度的升高,制得的凝膠珠形狀成規(guī)則的圓球狀,但隨著海藻酸鈉濃度的增加,使得溶液粘度增加,導(dǎo)致針頭堵塞,凝膠珠形成困難。海藻酸鈉的濃度為2.5%時(shí),形成的凝膠珠大小均勻,對(duì)Fe2+的氧化效果較好。
圖2 海藻酸鈉濃度對(duì)Fe2+氧化率的影響Fig.2 The effect of sodium alginate concentrate of oxidize rate for Fe2+
取濃度為2%的CaCl2,海藻酸鈉濃度為2.5%,細(xì)胞 終 濃 度 分 別 為3×108、6×108、9×108、1.2×109、1.5×109,進(jìn)行細(xì)胞固定化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)調(diào)整細(xì)胞終濃度,研究其對(duì)Fe2+的氧化率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知,細(xì)胞濃度為1.2×109時(shí),F(xiàn)e2+的氧化效果最好。隨著細(xì)胞濃度的增加,F(xiàn)e2+的氧化率呈先升高后降低的趨勢(shì),其主要原因是海藻酸鈉對(duì)細(xì)胞的包埋具有飽和性,當(dāng)細(xì)胞濃度超過(guò)1.2×109時(shí),海藻酸鈉包埋的細(xì)胞制得的凝膠珠傳質(zhì)及傳氧性變差。
海藻酸鈉- 氯化鈣能較好的固定At. ferrooxidanscells 菌株,最佳固定化條件為:CaCl2濃 度 為 2% , 海 藻 酸 鈉 濃 度 為 2.5% ,At. ferrooxidanscells 細(xì)胞濃度為1.2×109cell·mL-1,對(duì)Fe2+的氧化率分別為99.83%、99.62%、99.42%。該方法制得的凝膠珠性質(zhì)穩(wěn)定,機(jī)械強(qiáng)度好,具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。
圖3 A.f 細(xì)胞數(shù)量對(duì)Fe2+氧化率的影響Fig.3 The effect of cell concentrate for the oxidize rate of Fe2+
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