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        全量程C-反應(yīng)蛋白定量檢測(cè)試劑盒的研制

        2018-12-14 01:27:38譚有將梁德智戴盡波余一海石星亮
        關(guān)鍵詞:分析檢測(cè)

        譚有將,梁德智,陳 靜,戴盡波,陳 耀,余一海,石星亮

        (1.廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院,廣東 佛山 528311;2.廣東順德墨賽生物科技有限公司,廣東 佛山 528311;3.廣東省佛山市順德北滘醫(yī)院,廣東 佛山 528311)

        C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,簡(jiǎn)稱CRP)最早由Tillet和Frances于1930首先發(fā)現(xiàn),是一種非常敏感的炎癥和組織損傷標(biāo)志物,因與肺炎雙球菌的莢膜C多糖起沉淀反應(yīng)而得名。CRP是機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下由肝臟合成的急性時(shí)相蛋白,在感染和非感染的許多疾病過程中,其濃度的改變可以提供有價(jià)值、及時(shí)的理論依據(jù)[1-6]。此外,C-反應(yīng)蛋白的輕度升高與冠狀動(dòng)脈事件、中風(fēng)及周圍血管病相關(guān),是一項(xiàng)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素;C-反應(yīng)蛋白已被證實(shí)是由慢性炎癥引發(fā)心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,檢測(cè)其濃度對(duì)心血管疾病的干預(yù)及預(yù)后起重要作用而被臨床重視[7-12]。

        目前市場(chǎng)上檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的試劑多以進(jìn)口的免疫比濁試劑為主[13],檢測(cè)成本居高不下,隨著醫(yī)改的不斷深入,人民群眾普遍希望在不斷提升醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量的同時(shí),醫(yī)療價(jià)格能降到比較合理的水平。本研究的目的是開發(fā)一種基于熒光免疫層析技術(shù)的試劑盒,采用高熒光強(qiáng)度的熒光微球進(jìn)行標(biāo)記,所使用的主要原材料大部分為國產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)原料廠家提供,在確保達(dá)到臨床所需的檢測(cè)要求的同時(shí),能夠大幅降低試劑的檢測(cè)成本。

        1 材料與方法

        1.1 儀器和試劑

        1)主要原材料:CRP包被用單克隆抗體,北新化成生物科技有限公司;CRP標(biāo)記用單克隆抗體,北京萬域美瀾生物科技有限公司;羊抗鼠IgG,洛陽市佰泰科生物技術(shù)有限公司;時(shí)間分辨熒光微球,Bangs Lab公司;CRP國際參考物質(zhì)為ERM?-DA474/IFCC;CRP純化抗原,桂林英美特生物技術(shù)有限公司;NC膜,型號(hào)HF135,美國Milipore公司;其它化學(xué)試劑為分析純或者化學(xué)純。2) 三維平面點(diǎn)膜噴金儀,上海金標(biāo)生物科技有限公司;熒光免疫分析儀,為廣州藍(lán)勃生物科技有限公司提供。3)臨床樣本:佛山市順德區(qū)北滘醫(yī)院提供。4)臨床對(duì)照試劑:芬蘭QuikRead go 檢測(cè)系統(tǒng)。

        1.2 方法

        1.2.1 時(shí)間分辨熒光抗體結(jié)合墊制備

        將時(shí)間分辨熒光微球取出置于離心管中,離心(18 000 rpm)60 min,棄上清,加入0.05 M MES(pH 6.0)清洗兩遍。加入EDC/NHS與室溫震蕩活化4 h后,離心(18 000 rpm)60 min。加入0.01 M PB(pH 7.0)將微球重懸,按1 mg微球標(biāo)記0.2 mg抗體的比例加入相應(yīng)抗體。室溫震蕩偶聯(lián)反應(yīng)2 h,加入0.5%的BSA室溫震蕩封閉2 h后,開始離心(10 000 rpm)60 min,棄上清,加入含0.5%BSA的0.01 M PBS,2~8 ℃保存?zhèn)溆谩?biāo)記好的抗體稀釋成0.5 mg/mL,使用三維平面點(diǎn)膜噴金儀噴膜到結(jié)合墊(4 ul/cm)上,37 ℃干燥5 h,制成時(shí)間分辨熒光抗體結(jié)合墊,于濕度為RH30%~40%的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 包被抗體NC膜制備

        用含0.5%乙醇胺的0.01 M PBS將CRP包被抗體配成0.5 mg/mL,然后使用三維平面點(diǎn)膜噴金儀將其按1.5 ul/cm進(jìn)行包被,同時(shí)包被1.5 mg/mL的羊抗鼠IgG,將NC膜于37 ℃干燥5 h,于濕度為RH30%~40%的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 試劑卡組裝

        將準(zhǔn)備好的吸水紙、樣品墊、PVC底板、試劑卡殼等包裝材料在濕度為RH30%~40%的環(huán)境下進(jìn)行組裝,并切成小條(寬3.8 mm/條),將試劑條裝入試劑卡殼中,并壓殼制成檢測(cè)的試劑卡。放入鋁箔袋中,加入干燥劑,密封后與2~8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.4 內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

        將CRP純化抗原使用QuikRead go 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行定標(biāo),并經(jīng)CRP國際校準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)后,配置成0.0、0.5、1.0、3.0、10.0、50.0、100.0、150.0 mg/L 的內(nèi)部校準(zhǔn)品,用制備好的試劑卡檢測(cè),利用時(shí)間分辨熒光免疫分析儀進(jìn)行判讀,記錄檢測(cè)的信號(hào)。將濃度與檢測(cè)信號(hào)按最小二乘法進(jìn)行擬合曲線,再將擬合好的曲線參數(shù)錄入到時(shí)間分辨熒光免疫分析儀中,成為內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.2.5 樣本檢測(cè)

        取10 uL全血或者5 uL血漿樣本,加入到2 mL的樣品稀釋液中,充分混勻后,取100 ul混合液滴入到試劑卡樣品孔中,室溫下反應(yīng)5 min后,用時(shí)間分辨熒光免疫分析儀判讀結(jié)果。

        1.2.6 性能評(píng)估

        分別使用CRP內(nèi)部校準(zhǔn)品、含干擾物的樣品等對(duì)試劑卡進(jìn)行檢測(cè),按照《體外診斷試劑分析性能評(píng)估系列指導(dǎo)原則(征求意見稿)》及《CRP技術(shù)審查指導(dǎo)原則》評(píng)估檢測(cè)系統(tǒng)的分析靈敏度、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、特異性及其穩(wěn)定性。

        1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        檢測(cè)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)、Kappa一致性分析、線性回歸和Bland-Altman等分析考核試劑的相關(guān)性、一致性。同時(shí)檢測(cè)來自同一病人全血/血漿樣品各40份,考核試劑卡對(duì)不同標(biāo)本的檢測(cè)能力。

        2 結(jié)果

        2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

        用內(nèi)部校準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試,每個(gè)濃度測(cè)試10次,剔除離群值后取平均值。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.0~150.0 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性范圍和相關(guān)性(r>0.98)。

        2.2 分析靈敏度

        以0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.0 mg/L的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品各測(cè)定20次,以變異系數(shù)接近20%的最低濃度作為試劑盒的分析靈敏度,結(jié)果如表1。表明該試劑盒的分析靈敏度為0.1 mg/L。

        表1 試劑盒的分析靈敏度檢測(cè)結(jié)果

        2.3 精密度

        選擇高(100.0 mg/L)、中(10.0 mg/L)、低(1.0 mg/L)三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精密考察,共考察了3批產(chǎn)品,結(jié)果如表2。表明該試劑盒的批內(nèi)精密度<15%,批間精密度<20%,符合要求。

        表2 試劑盒批內(nèi)及批間精密度檢測(cè)結(jié)果

        2.4 特異性

        選擇10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品濃度,分別在里面添加如表3中的物質(zhì)及其濃度,考察干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,結(jié)果如表3所示。表明干擾物質(zhì)對(duì)接觸結(jié)果影響甚微,偏差<10%,符合要求。

        表3 試劑盒干擾性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

        2.5 與國外試劑盒比較

        2.5.1 相關(guān)性分析

        使用對(duì)比試劑盒及本試劑盒分別按照各自的方法檢測(cè)40份人的血液樣本,進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。結(jié)果如下,相關(guān)系數(shù)r2=0.989,與對(duì)比試劑具有良好的相關(guān)性。如圖1所示。

        2.5.2 檢測(cè)樣本類型一致性分析

        對(duì)來自同一份人全血和血漿標(biāo)本各40份樣本進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)行回歸及相關(guān)性分析,相關(guān)系數(shù)r2=0.980,說明檢測(cè)全血和血漿具有良好的一致性。

        圖1 本試劑盒與對(duì)照試劑盒的相關(guān)性

        3 討論

        1)本試劑盒采用的主要原材料均為國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)原材料,大幅降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本,同時(shí)也能為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。配合本公司的快速時(shí)間分辨熒光免疫分析儀使用,能為患者現(xiàn)場(chǎng)提供快速、準(zhǔn)確的結(jié)果,特別適合中小型醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu),方便普通民眾的檢測(cè)需求。

        2)本試劑盒利用時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記抗體技術(shù),結(jié)合固相層析技術(shù),采用雙抗體夾心法原理,CRP單克隆抗體標(biāo)記時(shí)間分辨熒光物質(zhì)(熒光信號(hào)示蹤),通過時(shí)間分辨熒光免疫分析儀俘獲檢測(cè)區(qū)域(T區(qū))被激發(fā)的熒光信號(hào),通過檢測(cè)區(qū)域/質(zhì)控區(qū)域的值與分析物的不同濃度獲得定標(biāo)曲線,實(shí)現(xiàn)人全血/血漿中的CRP定量檢測(cè)。

        3)與一般的熒光物質(zhì)標(biāo)記不同,該方法采用了高熒光強(qiáng)度的時(shí)間分辨熒光微球進(jìn)行標(biāo)記,通過優(yōu)化標(biāo)記過程的每一個(gè)細(xì)節(jié),使檢測(cè)試劑盒具有靈敏度高、檢測(cè)樣本用量少,檢測(cè)結(jié)果快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,保存有效期長(zhǎng)的特點(diǎn)。

        4)本研究對(duì)試劑盒的精密度、靈敏度、線性范圍和偏倚進(jìn)行了分析和評(píng)估,并與進(jìn)口試劑進(jìn)行對(duì)比分析,兩者具有良好的相關(guān)性,比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。能夠滿足臨床的檢驗(yàn)需求。

        5)本研發(fā)過程采用了企業(yè)與醫(yī)療機(jī)構(gòu)聯(lián)合研發(fā)的模式,在確保研發(fā)質(zhì)量的同時(shí),能提高了研發(fā)效率,縮短研發(fā)周期,節(jié)省時(shí)間成本。

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