羅 皓，楊 博，何 樂，張詩珩，戴 楠，李夢俠，王 東（陸軍特色醫(yī)學(xué)中心腫瘤中心，重慶400042）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，2012年全球癌癥統(tǒng)計顯示，與2008年相比，全球乳腺癌患者例數(shù)增大20%以上，死亡率增加14%，其中我國乳腺癌患病人數(shù)為69.7萬，死亡人數(shù)為4.8萬[1]。在2011年乳腺癌分型中[2]，Luminal型和Her-2過表達(dá)型目前均有成熟的靶向治療藥物，但三陰乳腺癌（TNBC）尚缺少特異性靶向藥物，采用常規(guī)化療不敏感，面臨復(fù)發(fā)早、進(jìn)展快、生存期短的嚴(yán)峻問題。目前，TNBC的5年生存率僅為60%[3]，因此，尋找TNBC的治療靶點迫在眉睫。

大多數(shù)TNBC存在BRCA1基因突變，突變率約為70.4%。2009年美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO）報道，抑制聚APP核糖聚合酶1（PARP1）作為DNA修復(fù)相關(guān)的關(guān)鍵酶，可使BRCA1/2基因突變的細(xì)胞選擇性凋亡，以PARP1為靶點的分子治療可能成為TNBC新的治療手段。目前，臨床研究發(fā)現(xiàn)，PARP1抑制劑聯(lián)合放化療可明顯提高臨床受益率、無進(jìn)展生存時間和總生存時間，但單用PARP1抑制劑治療TNBC的有效率為41%，其可能存在不敏感或耐藥等問題[4-6]。與傳統(tǒng)放化療耐藥不同的是，單一分子靶向治療可能存在旁路途徑的激活，因此，尋找旁路途徑的分子靶點具有重要作用。

脫嘧啶（AP）核酸內(nèi)切酶（APE1）/氧化還原因子（Ref-1）具有DNA損傷修復(fù)和氧化還原雙功能，是堿基切除修復(fù)（BER）通路中的重要成員之一。在DNA損傷修復(fù)通路中，PARP1與APE1可競爭性參與BER修復(fù)通路，PARP1的抑制可能引起APE1介導(dǎo)的BER修復(fù)途徑的激活，從而影響PARP-1抑制劑的治療療效。本文對本院收治的60例三陰乳腺浸潤性癌患者，采用免疫組化方法檢測BRCA1、PARP1與APE1在三陰乳腺浸潤性癌組織中的表達(dá)，分析其相關(guān)性表達(dá)及與腫瘤預(yù)后的關(guān)聯(lián)，為TNBC開展PARP-1抑制劑的靶向治療提供參考和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年1月至2012年12月就診于第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院大坪醫(yī)院腫瘤中心的乳腺癌患者60例作為研究對象，年齡28～82歲，平均50.06歲，中位年齡47歲。所有患者均有明確術(shù)后病理診斷結(jié)果，所有標(biāo)本來自本院病理科標(biāo)本庫，病理診斷均為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，并且ER、PR、HER-2結(jié)果均為陰性。2014年11月進(jìn)行隨訪，2015年1月完成隨訪，生存期起止時間由手術(shù)當(dāng)日至死亡時間，或末次隨訪時間。所有患者均為漢族，相互間無血緣關(guān)系，本研究設(shè)計、臨床病例資料和標(biāo)本獲得第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，遵循倫理學(xué)要求。

1.2 方法 免疫組化結(jié)果顯示，組織呈棕色或棕黃色顆粒狀為陽性表達(dá)，APE1、PARP1和BRCA1表達(dá)均主要集中于細(xì)胞核，偶可見細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，BRCA1還可出現(xiàn)細(xì)胞膜表達(dá)。免疫組化分級方法采用陽性細(xì)胞數(shù)聯(lián)合染色強(qiáng)度評價方式，光鏡下，取腫瘤組織中癌細(xì)胞較多的5個高倍視野（400×），分別計數(shù)500個細(xì)胞，計算其中陽性細(xì)胞數(shù)量，≤10%計1分，＞10%～50%計2分，＞50%～75%計3分，＞75%則計4分；染色強(qiáng)度分級為：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合評分判定標(biāo)準(zhǔn)為：將上述2項得分相乘，結(jié)果 0～2分計為“-”，3～4分計為（+），6～8分計為（++），9～12計為（+++），其中（-～+）定義為陰性表達(dá)，（++～+++）定義為陽性表達(dá)。實驗中所需的試劑配置、石蠟切片步驟及免疫組化方法參照張詩珩[7]報道。

表1 3種標(biāo)志物與乳腺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用χ2檢驗分析PARP1、APE1和BRCA1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性；PARP1與APE1表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman非參數(shù)等級相關(guān)分析，采用Kaplan-Meier法分析患者生存時間，生存率差別采用Log-Rank檢驗，多變量Cox回歸評估各臨床病理參數(shù)對預(yù)后的相對危險度，所有檢驗為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3種標(biāo)志物在TNBC中的表達(dá)特點 APE1與PARP1表達(dá)定位于細(xì)胞核和（或）胞質(zhì)，BRCA1表達(dá)主要位于細(xì)胞核，也可見于細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜，其表達(dá)情況見圖1。三者陽性表達(dá)率分別為：APE1陽性35例（58.3%），陰性25例（41.7%）；PARP1陽性34例（56.7%），陰性26例（43.3%）；BRCA1陽性 21例（35.0%），陰性 39例（65.0%）。

圖1 3種標(biāo)志物在TNBC組織中的表達(dá)（400×）

2.2 3種標(biāo)志物與乳腺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 PARP1表達(dá)在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分組中明顯有差異，在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的癌組織中表達(dá)明顯高于腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.009）；而PARP1表達(dá)在發(fā)病年齡、腫瘤大小、組織分化及臨床分期的分組間無明顯差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05））；APE1和 BRCA1在組織分化的分組間存在統(tǒng)計學(xué)差異，且在分化程度差的癌組織中APE1表達(dá)顯著增高（P=0.027），而 BRCA1表達(dá)顯著降低（P=0.017）。見表1。

2.3 3種標(biāo)志物表達(dá)的相關(guān)性 Spearman等級相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，APE1與 PARP1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.489，P＜0.001），與BRCA1的表達(dá)無相關(guān)性；同樣，BRCA1與PARP1表達(dá)無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見表2。

2.4 3種標(biāo)志物表達(dá)與患者生存時間及預(yù)后的關(guān)系 壽命表分析顯示，APE1陽性表達(dá)患者的3年生存率為43%，陰性表達(dá)患者為79%，二者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.021），見表3，圖 2、3。比較 APE1 和PARP1均陽性患者（27例）生存時間與均陰性患者（18例）3年生存率的差異，壽命表分析顯示，與共表達(dá)陰性患者相比，共表達(dá)陽性患者3年生存率明顯縮短，分別為37%和75%（P=0.032）。通過多因素Cox回歸分析，對60例患者臨床病理參數(shù)的風(fēng)險預(yù)測發(fā)現(xiàn)，年齡、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化差及APE1陽性表達(dá)是TNBC獨立的預(yù)后因子，顯著降低患者生存時間，見表4。

表2 3種標(biāo)志物兩兩表達(dá)相關(guān)性

表3 APE1、PARP1及共表達(dá)的3年生存率

圖2 APE1表達(dá)生存曲線

圖3 PARP1表達(dá)生存曲線

表4 多因素Cox回歸分析臨床病理參數(shù)風(fēng)險預(yù)測

續(xù)表4 多因素Cox回歸分析臨床病理參數(shù)風(fēng)險預(yù)測

3 討 論

TNBC即ER、PR、HER2三者均陰性表達(dá)，其惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差、具有獨立的臨床病理類型。有研究表明，大多數(shù)TNBC存在BRCA1基因突變，BRCA1缺陷細(xì)胞其DNA雙鏈斷裂修復(fù)減弱，主要以PARP1通路代償[8]。PARP1廣泛表達(dá)于高等真核細(xì)胞中，介導(dǎo)DNA單鏈及雙鏈損傷修復(fù)，PARP1識別DNA缺口，通過N端DNA結(jié)合域中2個鋅指模序結(jié)合于單鏈或雙鏈DNA缺口。識別DNA缺口后活化的PARP1形成同型二聚體并催化NAD分解成ADP核糖與煙酰胺，再利用前者作為主要原料，促使受體蛋白發(fā)生聚ADP核糖化，進(jìn)一步影響相關(guān)蛋白的修復(fù)能力。乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2在同源重組和單核苷酸切除修復(fù)中發(fā)揮重要作用，其突變或缺失可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。當(dāng)BRCA1/2介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路缺失時，PARP1的功能對雙鏈斷裂修復(fù)有重要意義，因此，以PARP1為靶點的分子治療可能成為TNBC的治療希望[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC組織中PARP1陽性表達(dá)率較高，且在發(fā)生腋窩淋巴結(jié)專一的患者中，PARP1表達(dá)增高，生存分析也提示PARP1陽性表達(dá)的患者生存時間更短。上述結(jié)果均提示，PARP1蛋白可能參與TNBC的發(fā)生、發(fā)展，其表達(dá)水平升高可能參與了乳腺上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及侵襲。

BER是真核細(xì)胞中重要的DNA損傷修復(fù)途徑，其主要負(fù)責(zé)內(nèi)生活性氧物質(zhì)引起的堿基損傷和外源性電離輻射、烷化劑等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的DNA氧化損傷，糖基化酶又稱糖苷水解酶，可特異性切除受損核苷酸上的N-β-糖苷鍵，形成AP位點，AP核酸內(nèi)切酶切除含有AP位點的脫氧核糖-5-磷酸，再由DNA聚合酶合成新的DNA片斷，最終由DNA連接酶將斷端連接。BER包含長補(bǔ)丁及短補(bǔ)丁2種修復(fù)途徑，PARP-1除了參與DNA雙鏈修復(fù)途徑外，也是BER修復(fù)途徑中的重要參與者[11]。PARP-1 可通過與 polβ、FEN1、DNA 連接酶Ⅰ、XRCC1等相關(guān)修復(fù)蛋白酶作用介導(dǎo)長補(bǔ)丁BER途徑[12]。APE1具有DNA修復(fù)活性，是BER途徑的限速酶，其主要通過2種機(jī)制參與BER修復(fù)途徑[13]：（1）在短補(bǔ)丁BER中，甲基嘌呤DNA糖基化酶切除受損的堿基后，DNA骨架仍然保持完整性，APE1發(fā)揮5'-核酸內(nèi)切酶活性，使DNA鏈出現(xiàn)5'-斷端，然后由polβ發(fā)揮5'-端脫氧核糖磷酸酶活性產(chǎn)生3'-端磷酸基團(tuán)，APE1以此3'-端磷酸鹽為底物在AP位點處產(chǎn)生一個3'-端羥基基團(tuán)和一個5'-端脫氧核糖磷酸基團(tuán)，最終在polβ、XRCC1/DNA連接酶Ⅲ或DNA連接酶Ⅰ的作用下連接斷端，完成修復(fù)。（2）長鏈修復(fù)在BER途徑中起次要作用，主要對AP位點附近4～8個堿基進(jìn)行替換，糖基化酶切除受損堿基，產(chǎn)生AP位點，再由APE1發(fā)揮5'-核酸內(nèi)切酶活性，使DNA鏈出現(xiàn)5'-斷端，進(jìn)而polβ依賴復(fù)制因子C、增殖細(xì)胞核抗原等完成核苷酸的再次合成，DNA連接酶Ⅰ、DNA連接酶Ⅲ/XRCCl封閉缺口，修復(fù)完成。由此可見，APE1與PARP-1均可介導(dǎo)BER修復(fù)活性，二者可競爭性結(jié)合BER途徑的中間產(chǎn)物，參與BER修復(fù)通路。研究中發(fā)現(xiàn)，APE1在TNBC中陽性表達(dá)率高，且與組織分化差相關(guān)，生存分析也揭示APE1陽性表達(dá)患者生存時間顯著低于APE1陰性表達(dá)患者，其可作為TNBC預(yù)后的獨立因素[OR=6.853，95%CI（1.648～28.501），P=0.008]；進(jìn)一步分析APE1與 PARP1表達(dá)相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)，APE1和PARP1在 TNBC中表達(dá)呈正相關(guān)，[R2=0.489，P＜0.001），且APE1與PARP1表達(dá)均陽性的患者生存時間更短，上述結(jié)果提示，APE1和PARP1可能存在相互作用，影響TNBC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。

在TNBC組織中，APE1與PARP1表達(dá)呈正相關(guān)，二者聯(lián)合檢測對TNBC的預(yù)后評估具有一定價值。因此，阻斷APE1及PARP1信號通路有望成為TNBC的治療新策略。