陳博 孫曉巖 袁細妹

MTHFR作為葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶,可將葉酸代謝通路中將5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化成具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸,從而進入甲基傳遞通路,為Hcy提供甲基,使血漿Hcy保持在較低水平。血漿Hcy水平上升與孕期疾病和出生缺陷有關(guān),同時也是誘發(fā)心血管疾病的主要危險因素之一［1-4］。本研究通過對MTHFR不同基因型增補葉酸效果進行研究,為制定個性化葉酸增補方案提供參考,旨在減少出生缺陷,預防孕期及心腦血管疾病?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2016年1～8月本院招募的120例健康女性志愿者作為研究對象,年齡22～45歲,平均年齡(33.52±4.34)歲。納入標準：無家族性遺傳病史；無免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、慢性疾病者；入組前1周未曾服用葉酸或B族維生素。排除標準：妊娠期、哺乳期女性；既往有胃腸切除手術(shù)史者；肝、腎功能不全者。所有入選者均簽署知情同意書。

1. 2 方法

1. 2. 1 基因檢測 對所有受檢者進行空腹抽取外周靜脈血5 ml,DNA提取通過柱式抽提試劑盒進行抽提,提取結(jié)束后并進行DNA濃度測定。蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)A66G、MTHFR A1298C、C677T 的基因多態(tài)性采用 MASS ARRAY技術(shù)進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型檢測,利用MASS ARRAY的引物設(shè)計平臺設(shè)計聚合酶鏈式反應(PCR)引物,包括一對多重PCR擴增引物,及一條MASS EXTEND延時引物。然后進行 PCR,每個反應體系總體積為 5 μl,1 μl包含濃度為 20 ng/μl的 DNA 模板 ,1.8 μl無酶水 ,0.5 μl 10×PCR buffer,0.4 μl 25 μM MgCl2,0.1 μl 25 μM dNTP Mix,1 μl 0.5 μM Primer Mix,0.2 μl 5 U/μl PCR Enzyme。設(shè)定反應條件為 ：95℃ 2 min,然后再完成 20 個循環(huán)的擴增 (95℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min)與 45 個循環(huán)的擴增。結(jié)束整個反應過程之后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過樹脂純化后在 Nanodispenser Spectro CHIP 芯片上點樣 ,然后進行MASS ARRAY 分析 ,每個檢測點只需 3～5 s,全自動分析 ,通過TYPPER4.0軟件分析實驗結(jié)果。

1. 2. 2 研究分組 根據(jù)MTHFR 677C/T基因型檢測結(jié)果分為CC型37例、CT型42例、TT型41例。根據(jù)是否增補葉酸再將三種基因型隨機分為觀察組和對照組,CC型的觀察組19例,對照組18例；CT型的觀察組和對照組各21例；TT型的觀察組21例,對照組20例。CC型、CT型、TT型基因的觀察組口服葉酸片 400～800 μg/次 ,1 次 /d,連續(xù)服用 8 周；對照組不給予任何干預。試驗期間,所有研究對象禁服含有葉酸或B族維生素成分的營養(yǎng)補充劑。

1. 3 血液指標檢測 以下指標在干預前和干預后2個月各檢測1次。上午空腹抽取肘正中靜脈血。檢測血漿葉酸水平和Hcy水平；使用羅氏電化學發(fā)光儀E602,按照試劑盒說明書操作步驟完成血清葉酸檢測,日立7600全自動生化儀進行檢測,按照試劑盒說明書操作步驟完成Hcy檢測,其中Hcy在5～15 μmol/L濃度范圍內(nèi)視為正常。

1. 4 觀察指標 采集受試者肘正中靜脈血,比較CC型、CT型、TT型及三種基因的觀察組和對照組的血漿葉酸水平、血漿Hcy水平。

1. 5 統(tǒng)計學方法 采用Empower Stats與R軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,滿足正態(tài)分布時,采用t檢驗或方差檢驗；不同時滿足正態(tài)分布和方差齊時,采用秩和檢驗,P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 不同基因型血漿葉酸、血漿Hcy水平比較 TT型的血漿葉酸水平明顯低于CT型、CC型,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TT型的血漿Hcy明顯高于CT型、CC型,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2. 2 不同基因型觀察組與對照組血漿葉酸、血漿Hcy水平比較 干預后,CC型、CT型、TT型基因的觀察組血漿葉酸水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；TT型基因的觀察組血漿Hcy水平低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表 2。

表1 不同基因型血漿葉酸、血漿Hcy水平比較( )

表1 不同基因型血漿葉酸、血漿Hcy水平比較( )

注 ：與 TT 型比較 ,aP＜0.05

基因型 例數(shù) 血漿葉酸(μg/L) 血漿Hcy(μmol/L)TT 型 41 5.76±1.56 14.15±2.07 CT型 42 6.57±1.68a 11.36±1.81a CC型 37 9.41±1.77a 10.64±1.36a

表2 不同基因型的觀察組與對照組血漿葉酸、血漿Hcy水平比較( )

表2 不同基因型的觀察組與對照組血漿葉酸、血漿Hcy水平比較( )

注 ：與對照組比較 ,aP＜0.05

基因型 組別 例數(shù) 干預前 干預后血漿葉酸(μg/L) 血漿Hcy(μmol/L) 血漿葉酸(μg/L) 血漿Hcy(μmol/L)TT型 觀察組 21 5.43±1.96 14.31±1.46 11.46±1.76a 8.33±1.25a對照組 20 5.83±1.46 13.82±1.33 6.93±1.56 12.12±1.33 CT型 觀察組 21 6.85±1.76 11.69±1.14 11.58±1.54a 7.39±1.43對照組 21 6.45±1.51 9.86±1.37 7.55±1.44 7.16±1.45 CC型 觀察組 19 9.37±1.80 10.29±1.08 21.57±1.32a 8.19±1.28對照組 18 8.67±1.57 9.45±1.25 9.27±1.75 8.45±1.25

3 討論

MTHFR是人體葉酸代謝中的非常重要的酶,該酶能夠通過Hcy的重新甲基化過程為蛋白質(zhì)及DNA的甲基化提供甲基,從而降低Hcy水平。Hcy水平上升與孕期疾病、出生缺陷、動脈粥樣硬化及心肌梗死等心血管疾病密切相關(guān)［5,6］。葉酸是一種水溶性維生素,其主要作用是降低神經(jīng)管畸形和唇裂胎兒出生率。葉酸被人體吸收后會以N5-甲基四氫葉酸形式存在于血液中,并與白蛋白疏松結(jié)合后經(jīng)葉酸受體攝入細胞中,并在維生素B12依賴的蛋氨酸合成酶的作用下形成四氫葉酸,從而發(fā)揮自身作用［7］。MTHFR在葉酸的代謝過程中具有重要作用 ,研究指出［8］,MTHFR 677C/T 的基因多態(tài)性對該酶的活性有一定影響,從而造成葉酸代謝障礙,增加孕期疾病、出生缺陷、心血管疾病的發(fā)生風險。由于不同MTHFR基因分型對機體葉酸代謝的影響不同,因此通過檢測MTHFR基因的多態(tài)性,為臨床增補葉酸提供科學依據(jù)［9,10］。

本研究結(jié)果顯示,TT型的血漿葉酸水平明顯低于CT型、CC型,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TT型的血漿Hcy明顯高于CT型、CC型,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明MTHFR基因分型與血漿葉酸、Hcy水平有關(guān),且TT型基因發(fā)生葉酸代謝障礙、血漿Hcy水平上升的風險最高。原因可能是MTHFR基因突變可降低MTHFR酶活性,且對TT型基因的MTHFR酶活性降低最明顯［7］。

經(jīng)葉酸干預后,CC型、CT型、TT型的觀察組血漿葉酸水平均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明葉酸干預后,可提高三種基因型受試者的血漿葉酸水平,對于預防孕期疾病、出生缺陷、心血管疾病有一定作用。經(jīng)葉酸干預后,TT型的觀察組Hcy水平明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而在其他兩種基因型中,Hcy水平下降并不明顯。表明在TT型基因較CC型、CT型基因有更明顯的Hcy下降反應。雖然TT型基因的觀察組Hcy水平降低幅度最大,但其Hcy水平均較CC型、CT型基因的觀察組Hcy水平高?？紤]原因可能是TT基因型的Hcy水平較高有關(guān),除此之外還可能與樣本量有關(guān),今后可進行多中心、大樣本的研究予以證實。

綜上所述,對MTHFR三種基因型人群增補葉酸均可提高血漿葉酸水平,降低TT型Hcy水平。TT型基因?qū)θ~酸治療較敏感,尤其在降低Hcy水平上有一定優(yōu)勢。