趙玉蓉 王耀東

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128)

腸黏膜屏障可有效地阻擋腸道內(nèi)微生物及其毒素向腸腔外組織擴(kuò)散和病原微生物的入侵[1-2]，而其黏膜上皮細(xì)胞間良好的緊密連接結(jié)構(gòu)是維持腸黏膜發(fā)揮正常屏障功能和吸收功能的前提[3]。研究表明，緊密連接是依靠一系列跨膜及外周蛋白相互作用形成的復(fù)合體，包括跨膜的閉鎖蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudin)和細(xì)胞質(zhì)密閉小帶(ZO)1～3等多種蛋白[4-5]，一旦這些蛋白的表達(dá)和定位發(fā)生改變，就會誘導(dǎo)宿主細(xì)胞骨架重排、連接結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞通透性升高，對抗原物質(zhì)的屏障功能減弱，病原體將通過上皮細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體，引發(fā)一系列腸道疾病[6-9]。沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌，可以通過誘導(dǎo)吞噬作用侵入腸上皮細(xì)胞并在含沙門氏菌液泡中存活和繁殖[10]，在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，極易感染2～4月齡的仔豬，導(dǎo)致仔豬腹瀉，甚至死亡[11]。庾慶華[6]研究表明，沙門氏菌SL1344和SARB21感染人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)后，occludin、claudin-1、ZO-1等蛋白表達(dá)下降，分布分散，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞輪廓不清晰。牛膝多糖(Achyranthesbidentatapolysaccharides，ABPS)是從莧科植物牛膝中提取、分離、純化得到的一種生物活性多糖，具有抗氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等系列作用[12]。陳清華[13]研究表明，飼糧中添加適量的ABPS能顯著抑制腸道病原菌生長，顯著降低仔豬腹瀉發(fā)生率，但這是否與ABPS參與調(diào)控腸上皮細(xì)胞間緊密連接的形成有關(guān)目前鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在以豬小腸上皮細(xì)胞(intestinal porcine epithelial cells-1，IPEC-1)為研究對象，人為感染沙門氏菌，探討ABPS處理對沙門氏菌侵染IPEC-1的影響，以期為仔豬的健康養(yǎng)殖以及ABPS的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

IPEC-1、沙門氏菌817菌株均由德州農(nóng)工大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院惠贈。

ABPS購自武漢東康源科技有限公司，純度99%。

1.2 主要試劑及配制

DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、雙抗試劑購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、細(xì)胞凍存液購自Gibco公司；D-Hank’s緩沖液、中性磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Biotopped公司；Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)和SYBR Premix EX TaqTMⅡ(RR820A)試劑盒均購自寶生物(大連)工程有限公司；表皮生長因子(EGF)、ITS liquid Media Supplement(100 ×)購自Sigma公司。

100 mg/mL ABPS母液：稱取ABPS粉末0.500 g，溶于5 mL三蒸水中，0.22 μm微孔濾膜抽濾器抽濾除菌，分裝，-20 ℃保存。

LB液體培養(yǎng)基：分別稱取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl，加入950 mL雙蒸水中溶解，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0，定容至1 L，121 ℃、20 min高壓滅菌，4 ℃儲存。

LB固體培養(yǎng)基：分別稱取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl，加入950 mL雙蒸水中溶解，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0，定容至1 L，然后加入15 g瓊脂粉，121 ℃、20 min高壓滅菌，待冷卻至50～60 ℃時(shí)，倒制平板。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：95% DMEM/F12培養(yǎng)基+5% FBS+5 μg/L EGF+1‰ ITS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素。

5 mg/mL噻唑藍(lán)(MTT)：稱取0.5 g MTT，溶于100 mL PBS中，0.22 μm微孔濾膜抽濾器抽濾除菌，4 ℃避光保存。

1.3 主要方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

IPEC-1經(jīng)活化后，培養(yǎng)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80%～90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，收集細(xì)胞用于細(xì)胞傳代或后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 ABPS對IPEC-1增殖的影響

將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)劑量的ABPS，使培養(yǎng)基中ABPS終濃度分別為0(對照)、50、100、200、400 μg/mL，分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)孔)，加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，加150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，搖床低速振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測吸光度值(OD值)。細(xì)胞增殖以O(shè)D值呈現(xiàn)。

1.3.3 沙門氏菌對IPEC-1的侵染

沙門氏菌的準(zhǔn)備：細(xì)胞消化分板當(dāng)天，挑取單個(gè)817菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)過夜(10～12 h)，然后取10 μL菌液于另1支5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)(20～24 h),1 000 r/min離心10 min，棄上清，用5 mL不含抗生素和FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)菌。

將細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)劑量的ABPS，使培養(yǎng)基中ABPS終濃度分別為0(對照)、50、100、200、400 μg/mL(每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)孔)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS潤洗2次；每孔加入100 μL沙門氏菌懸液，1 000 r/min室溫離心10 min，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h；吸棄上清液，PBS潤洗2次；每孔加入含慶大霉素(100 μg/mL)無FBS的培養(yǎng)基1 mL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h；吸棄培養(yǎng)基，PBS潤洗3次；每孔加入200 μL 1% Triton X-100裂解液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5 min；每孔加入800 μL PBS，反復(fù)吹打，然后移入1.5 mL離心管，用PBS按10倍次方依次稀釋。

每個(gè)LB培養(yǎng)皿(內(nèi)徑9 cm)中分別接種100 μL的上述裂解稀釋液(10-3、10-4、10-5，每個(gè)稀釋液重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿)，用滅菌棒涂抹均勻，待菌液完全吸收后，倒置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h。

菌落數(shù)的計(jì)數(shù)(CFU/皿)：用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。

1.3.4 ABPS對IPEC-1緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)劑量的ABPS，根據(jù)1.3.3侵染結(jié)果，本試驗(yàn)培養(yǎng)基中ABPS終濃度分別為0(對照)、50、200 μg/mL(每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)孔)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS潤洗2次；每孔加入1 mL Trizol，按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA。

cDNA合成：按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser操作說明書進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后-20 ℃保存?zhèn)溆?。引物均由上海生工生物有限公司合成，具體信息見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ操作說明書在CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Premix EX Taq Ⅱ，2 μL稀釋后的cDNA模板，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，雙蒸水6.4 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；熔解曲線從60至95 ℃逐步升溫(每5 s增加0.5 ℃)獲得。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-△△Ct法進(jìn)行目的基因的相對表達(dá)量計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，之后采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABPS對IPEC-1增殖的影響

由表2可知，用不同濃度ABPS分別處理IPEC-1細(xì)胞12、24、48、72 h后檢測細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)時(shí)間條件下各組間IPEC-1細(xì)胞活性均無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 ABPS對沙門氏菌侵染IPEC-1的影響

由表3可知，用不同濃度的ABPS處理IPEC-1細(xì)胞48 h，然后接種沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)各組間細(xì)胞被侵染的沙門氏菌數(shù)量差異極顯著(P<0.01)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，ABPS顯著抑制沙門氏菌侵染IPEC-1，其抑制效果呈先增加后下降的趨勢。培養(yǎng)基中添加50 μg/mL ABPS抑制沙門氏菌侵染IPEC-1的效果最強(qiáng)，極顯著高于對照組和200、400 μg/mL ABPS組(P<0.01)，與100 μg/mL ABPS組的差異不顯著(P>0.05)。

2.3 ABPS對IPEC-1緊密連接相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響

由表4可知，不同組間IPEC-1緊密連接相關(guān)蛋白RAC1、ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA的相對表達(dá)量均存在極顯著差異(P<0.01)。與對照組相比，0、200 μg/mL ABPS均顯著上調(diào)RAC1、ZO-1、occludin和claudin-1 mRNA的相對表達(dá)量。其中，RAC1 mRNA的相對表達(dá)量分別增加77%、48%；ZO-1 mRNA的相對表達(dá)量分別增加79%、64%；occludin mRNA的相對表達(dá)量分別增加125%、81%；claudin-1 mRNA的相對表達(dá)量分別增加218%、140%。與50 μg/mL ABPS組相比，200 μg/mL ABPS組的RAC1、occludin和claudin-1的mRNA相對表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。

表2 ABPS對IPEC-1增殖的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 ABPS對沙門氏菌侵染IPEC-1的影響

表4 ABPS對IPEC-1緊密連接相關(guān)蛋白mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討 論

大量研究表明，ABPS對腸道功能有改善作用，并且可以改善免疫系統(tǒng)。秦文雅[14]研究表明，ABPS可以改善LPS應(yīng)激對腸道吸收功能以及免疫功能的影響。李孟偉[15]研究表明，細(xì)胞培養(yǎng)基中添加300～1 200 μg/mL的APBS能夠顯著地促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)的增殖，并且適宜的ABPS對IPEC-J2生長有一定的保護(hù)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，ABPS對IPEC-1的增殖無顯著影響。

沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌，通常在動物腸道內(nèi)感染，也會通過污染食物引起人類食物中毒。在各類細(xì)菌引起的食物中毒中，沙門氏菌中毒是最為常見的疾病之一[16]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，由于仔豬的腸道功能發(fā)育不完善、免疫能力低下，沙門氏菌極易感染2～4月齡的仔豬，致使仔豬體溫升高、精神不振、長時(shí)間發(fā)生腹瀉、生長發(fā)育緩慢、停滯等，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生敗血癥，最終導(dǎo)致仔豬死亡[11,17]。本研究結(jié)果表明，ABPS預(yù)處理的IPEC-1能顯著抵抗沙門氏菌的侵染，此現(xiàn)象與陳清華[13]、馬杰等[18]的報(bào)道相似，即飼糧中添加適量的ABPS能顯著抑制斷奶仔豬腸道病原菌的生長，一定劑量的ABPS在體外有抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的效果。

小腸上皮細(xì)胞間良好的緊密連接結(jié)構(gòu)是維持小腸黏膜發(fā)揮正常屏障功能和吸收功能的前提。而緊密連接是依靠一系列跨膜及外周蛋白相互作用形成的復(fù)合體，其功能依賴于細(xì)胞連接蛋白、細(xì)胞骨架蛋白的正常表達(dá)和分布以及黏附連接的完整性。一旦這些蛋白的表達(dá)和定位發(fā)生改變就會導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損、通透性增高，各種病原菌及毒素經(jīng)腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，引起腸道炎癥[19-21]。庾慶華[6]體外(Caco-2細(xì)胞單層模型)和體內(nèi)(大鼠)試驗(yàn)均表明，沙門氏菌SL1344和SARB21感染后，occludin、claudin-1和ZO-1等蛋白的分布較正常組分散，表達(dá)顯著下降，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞輪廓不清晰。RAC1廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞內(nèi)，在維持、增強(qiáng)和恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能中發(fā)揮著重要的作用[22]。機(jī)體生理情況下基礎(chǔ)水平的RAC1活性在細(xì)胞黏著連接和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)形成及維持兩者連接上起著重要作用[23]。研究表明，運(yùn)用RAC1抑制劑干擾抑制RAC1的活化，將導(dǎo)致黏著連接復(fù)合體的破壞以及細(xì)胞骨架肌動蛋白之間連接的破壞[24-26]。本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加ABPS，能顯著上調(diào)IPEC-1細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白(RAC1、ZO-1、occludin、claudin-1)mRNA的相對表達(dá)量，顯著抑制沙門氏菌的侵染，這說明ABPS能通過促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)，維持腸道黏膜結(jié)構(gòu)的完整，從而抑制病原菌的侵染。

4 結(jié) 論

① ABPS濃度在0～400 μg/mL對IEPC-1的增殖無顯著的影響。

② ABPS處理后的IEPC-1能顯著抑制沙門氏菌的侵染，隨著ABPS濃度的增加，其抑制效果呈先增加后降低的變化。

③ 50、200 μg/mL ABPS可以顯著上調(diào)IEPC-1緊密連接相關(guān)蛋白mRNA的相對表達(dá)量。