劉曉東 彭利蘭 何勝梅 張 森 莘海亮 吳邦元*

(1. 黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，凱里556000；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南充637009)

蛋氨酸與生物體內(nèi)各種含硫化合物的代謝密切相關(guān)，參與新蛋白質(zhì)的合成[1-2]。動(dòng)物的快速生長(zhǎng)常與蛋白質(zhì)的合成速度呈正比例關(guān)系[3]，而蛋白質(zhì)的合成也是腸道生長(zhǎng)發(fā)育的重要基礎(chǔ)。氨基酸可促進(jìn)腸道的生長(zhǎng)發(fā)育，如4.82%支鏈氨基酸可促進(jìn)肉雞腸道的生長(zhǎng)發(fā)育[4]，外源谷氨酰胺的添加也可顯著促進(jìn)肉仔雞早期腸道的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。此外，飼糧中粗蛋白質(zhì)水平也可影響豬的生產(chǎn)性能以及胃腸道的發(fā)育[6]。因此，蛋氨酸可能對(duì)動(dòng)物的腸道的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的作用。

動(dòng)物對(duì)蛋氨酸需要量因不同品種、不同日齡、不同生理狀態(tài)(如妊娠期、哺乳期以及幼仔期)以及不同性別而有差異。蛋氨酸供應(yīng)不足將會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)性能以及生理功能受損。蛋氨酸缺乏會(huì)降低肉仔雞體重、食物攝入量和飼料轉(zhuǎn)化效率[7]，導(dǎo)致機(jī)體蛋白質(zhì)合成減少[8]，影響細(xì)胞氧化功能[9]。蛋氨酸缺乏也會(huì)造成肉仔雞免疫器官受損[10-12]。除此之外，蛋氨酸缺乏也可影響心臟、肝臟等臟器某些酶的活性，引起嚴(yán)重的肝臟組織損傷[13]。然而，目前尚未見(jiàn)到蛋氨酸缺乏對(duì)腸道發(fā)育及其功能的研究。

腸道是機(jī)體接觸外界抗原物質(zhì)最直接的部位，腸道具有消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、電解質(zhì)以及吸收水的功能，也可以分泌一些酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而管腔內(nèi)黏膜系統(tǒng)屬于重要的機(jī)體免疫系統(tǒng)，對(duì)于機(jī)體防御機(jī)能具有重要作用[14]。已有研究指出，腸道的吸收功能與其形態(tài)學(xué)有著密切的相關(guān)性，任何形態(tài)學(xué)的改變都會(huì)導(dǎo)致腸道的功能受損[15-16]。因此，本試驗(yàn)主要通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察小腸絨毛高度、隱窩深度，以及通過(guò)組織化學(xué)方法統(tǒng)計(jì)杯狀細(xì)胞的數(shù)量變化來(lái)研究蛋氨酸缺乏對(duì)肉仔雞小腸發(fā)育和功能的影響，為研究蛋氨酸對(duì)人及其他動(dòng)物腸道功能的影響提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼糧和試驗(yàn)動(dòng)物

選取1日齡科寶(Cobb)肉雞健雛120只，體重為(45±5)g，購(gòu)于四川省成都市溫江正大畜禽有限公司。使用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧作為對(duì)照組飼糧，試驗(yàn)組飼糧為在基礎(chǔ)飼糧中不額外添加蛋氨酸。飼糧參照NRC肉雞營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kilogram of diets：VA 12 500 IU，VD32 500 IU，VE 18.75 IU，VK 5.0 mg，VB12.5 mg，VB27.5 mg，VB65.0 mg，VB120.002 5 mg，泛酸 pantothenate 15 mg，煙酸 niacin 50 mg，葉酸 folic acid 1.25 mg，生物素 biotin 0.12 mg，Cu 10 mg，Mn 100 mg，Zn 100 mg，F(xiàn)e 100 mg，I 0.4 mg，Se 0.2 mg。

2)試驗(yàn)組蛋氨酸含量為實(shí)測(cè)值，其他為計(jì)算值。Met contents in experimental group were measured values, while the others were calculated values.

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：4%多聚甲醛、各濃度梯度(50%、65%、70%、75%、85%、90%、95%和100%)酒精、蘇木精、伊紅、過(guò)碘酸和Schiff染液等。

主要儀器：石蠟切片機(jī)(LEICA，KD-2258，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，中國(guó))、光學(xué)顯微鏡(OLMPUS，BA410，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，中國(guó))、顯微攝相系統(tǒng)(MoticamPro205A，尼康，日本)和Image Pro Plus v6.0(中國(guó))等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)管理

將120只肉仔雞隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，其中每組的1個(gè)重復(fù)用于全程觀察。試驗(yàn)期間2組肉仔雞分別飼喂基礎(chǔ)飼糧和蛋氨酸缺乏飼糧，飼養(yǎng)于不銹鋼制試驗(yàn)禽籠內(nèi)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)籠子，自由飲水和采食，其他飼養(yǎng)管理方式與常規(guī)育雛方案一致，試驗(yàn)期42 d。采樣時(shí)間點(diǎn)為第14、28和42天。

1.3.2 組織學(xué)觀察

分別于試驗(yàn)第14、28和42天，各組隨機(jī)選取5只雞剖殺，取十二指腸、空腸和回腸中段約1 cm的組織樣，置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)流水沖洗后，再使用75%、85%、95%和100%的酒精進(jìn)行各級(jí)脫水，之后用甲苯進(jìn)行透明處理，最后將樣品進(jìn)行浸蠟、包埋處理，再將樣品切成5 μm厚的薄片進(jìn)行貼片，再經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，從組織切片上選10個(gè)典型視野(絨毛完整、走向平直)，測(cè)量小腸絨毛高度和隱窩深度，其平均值作為測(cè)定數(shù)據(jù)并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C)值。

1.3.3 小腸杯狀細(xì)胞組織化學(xué)觀察

樣品采集及切片制作方法同小腸組織學(xué)觀察，染色方法用過(guò)碘酸希夫-阿利新藍(lán)染色法。

染色步驟如下：常規(guī)石蠟切片至水洗；阿利新藍(lán)液染色5 min(滴染)；自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水沖洗；過(guò)碘酸液染2～5 min，水洗；Schiff染液染30 min(或多)，水洗10 min(細(xì)水流沖洗)；可選用明礬蘇木精復(fù)染1 min左右，分化，藍(lán)化；最后水洗、脫水、透明、封片。

染色結(jié)果為杯狀細(xì)胞呈藍(lán)色(酸性黏蛋白)、品紅色(含中性黏蛋白)及藍(lán)紅混合色(含酸中性黏蛋白混合物)。

顯微照相，Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)。方法如下：每只雞各腸段分別取5張過(guò)碘酸希夫-阿利新藍(lán)染色的石蠟切片，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)杯狀細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)數(shù)結(jié)果采用Excel 2007進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析法比較試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異的顯著性,其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 蛋氨酸缺乏對(duì)肉仔雞小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.1.1 蛋氨酸缺乏對(duì)肉仔雞十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表2可知，28和42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉仔雞十二指腸絨毛高度顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；14、28和42日齡時(shí)，試驗(yàn)組肉仔雞十二指腸隱窩深度均顯著降低(P<0.05)；42日齡時(shí)，試驗(yàn)組肉仔雞十二指腸V/C值也顯著降低(P<0.05)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下表同。

* mean significantly different compared with the control group (P<0.05), ** mean extremely significantly different compared with the control group (P<0.01). The same as below.

2.1.2 蛋氨酸缺乏對(duì)肉仔雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表3可知，蛋氨酸缺乏對(duì)肉仔雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響變化趨勢(shì)與十二指腸相似。14、28和42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉仔雞空腸絨毛高度顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)；42日齡時(shí)，試驗(yàn)組肉仔雞空腸隱窩深度也極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；28和42日齡時(shí)，試驗(yàn)組肉仔雞空腸V/C值與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。

表3 蛋氨酸缺乏對(duì)肉仔雞空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.1.3 蛋氨酸缺乏對(duì)肉仔雞回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表4可知，14、28和42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉仔雞回腸絨毛高度均極顯著降低(P<0.01)，而隱窩深度也顯著或極顯著低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)；14和42日齡時(shí)，試驗(yàn)組肉仔雞回腸V/C值與對(duì)照組相比顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表4 蛋氨酸缺乏對(duì)肉仔雞回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.2 蛋氨酸缺乏對(duì)肉仔雞小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明杯狀細(xì)胞主要分布在小腸絨毛上皮細(xì)胞之間(圖1～圖3)和隱窩內(nèi)(圖4～圖6)。

如圖1所示，28和42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組十二指腸絨毛上皮細(xì)胞間的杯狀細(xì)胞數(shù)量呈顯著或極顯著減少(P<0.05或P<0.01)；如圖2所示，42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組空腸絨毛上皮細(xì)胞間的杯狀細(xì)胞數(shù)量極顯著減少(P<0.01)；如圖3所示，42日齡時(shí)，試驗(yàn)組回腸絨毛上皮細(xì)胞間的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)。

如圖4所示，42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組十二指腸隱窩間的杯狀細(xì)胞數(shù)量極顯著減少(P<0.01)；如圖5所示，28和42日齡時(shí)，試驗(yàn)組空腸隱窩間的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著或極顯著低于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)；如圖6所示，42日齡時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組回腸隱窩間的杯狀細(xì)胞也極顯著減少(P<0.01)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

* mean significantly different compared with the control group (P<0.05), ** mean extremely significantly different compared with the control group (P<0.01). The same as below.

圖1十二指腸絨毛上皮細(xì)胞間杯狀細(xì)胞

Fig.1 Goblet cells among epithelial cells of duodenal villi (400×)

圖2 空腸絨毛上皮細(xì)胞間杯狀細(xì)胞

圖3 回腸絨毛上皮細(xì)胞間杯狀細(xì)胞

3 討 論

腸道作為內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境相通的關(guān)鍵部位，具有十分重要的功能，尤其是小腸黏膜具有免疫屏障功能，可防止腸道微生物和其他毒素對(duì)腸道的侵襲，并且小腸作為動(dòng)物重要的消化吸收器官，具有消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、礦物質(zhì)鹽以及吸收水的功能[17]。小腸絨毛的完整性決定了其消化吸收的能力[18]，同時(shí)可以保護(hù)機(jī)體，防止機(jī)體吸收有害物質(zhì)。據(jù)研究顯示，飼糧中蛋氨酸的增加有助于維持?jǐn)嗄套胸i小腸黏膜的屏障功能[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致腸道發(fā)育受阻以及腸道屏障功能受損，主要表現(xiàn)在小腸絨毛高度、隱窩深度以及V/C值降低，小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。

腸道內(nèi)環(huán)境的直接表現(xiàn)為絨毛高度、隱窩深度和V/C值，這幾項(xiàng)指標(biāo)是反映腸道健康的重要參數(shù)。有研究已證實(shí)V/C值是評(píng)價(jià)機(jī)體腸道發(fā)育狀態(tài)的可靠指標(biāo)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中蛋氨酸缺乏會(huì)對(duì)十二指腸、空腸和回腸絨毛細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，包括絨毛高度縮短、隱窩深度降低以及V/C值降低。研究表明，絨毛高度的增加與腸道消化吸收功能增強(qiáng)密切有關(guān)，絨毛高度增加相當(dāng)于增加了小腸消化吸收的表面積，從而使它的刷狀緣酶表達(dá)活性增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸功能也隨之增強(qiáng)[23-24]。所以我們推測(cè)，蛋氨酸缺乏可能會(huì)影響腸道刷狀緣酶表達(dá)活性以及影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)新陳代謝等，最終使腸道相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和消化吸收能力減弱。此結(jié)果表明蛋氨酸缺乏會(huì)使小腸的結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致小腸的生長(zhǎng)發(fā)育受阻，動(dòng)物消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力受到抑制，從而降低了動(dòng)物生長(zhǎng)性能和影響動(dòng)物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。除此之外，因?yàn)槟c道中有黏膜免疫系統(tǒng)并包含多種參與免疫機(jī)制的免疫細(xì)胞，所以蛋氨酸缺乏亦可能影響免疫功能。

圖4 十二指腸隱窩間杯狀細(xì)胞

圖5 空腸隱窩間杯狀細(xì)胞

圖6 回腸隱窩間杯狀細(xì)胞

杯狀細(xì)胞廣泛的分布于腸道上皮細(xì)胞之間，并可分泌黏液[25-26]，其可合成和分泌大分子量的糖類(lèi)復(fù)合物——黏蛋白[27-28]。黏蛋白是一種糖蛋白，釋入管腔內(nèi)成為潤(rùn)滑性黏液涂布于上皮表面，對(duì)上皮具有保護(hù)作用，是保護(hù)腸道完整性和健康的第1道屏障[29-30]。我們的研究結(jié)果顯示，蛋氨酸缺乏組的杯狀細(xì)胞數(shù)量在十二指腸、空腸和回腸各段均顯著低于對(duì)照組。而腸道上皮細(xì)胞間杯狀細(xì)胞的數(shù)量變化與腸段、飲食習(xí)慣、飼養(yǎng)管理、病原體侵入、個(gè)體發(fā)育階段以及物種種類(lèi)密切相關(guān)[27]。在本研究中，通過(guò)對(duì)比蛋氨酸缺乏組與對(duì)照組的試驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的減少可能也與蛋白質(zhì)缺乏有關(guān)(動(dòng)物合成蛋白質(zhì)的起始氨基酸均為蛋氨酸)，并已有試驗(yàn)指出虹鱒魚(yú)飼糧中提高植物蛋白質(zhì)水平會(huì)使腸道中杯狀細(xì)胞數(shù)量增加[30]。通過(guò)本次研究表明，蛋氨酸缺乏會(huì)減少肉仔雞小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量，對(duì)杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，最終改變黏液層中黏蛋白的結(jié)構(gòu)組成及其理化性質(zhì)[31]，說(shuō)明小腸黏液層的保護(hù)功能降低，腸道的屏障功能受損。而黏蛋白導(dǎo)致的腸道屏障功能受損會(huì)影響腸道上皮細(xì)胞緊密連接的通透性、免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)等方面，從而會(huì)促使許多腸道疾病如炎癥性、潰瘍性和腫瘤性疾病的發(fā)生[32]。

4 結(jié) 論

蛋氨酸缺乏會(huì)造成肉仔雞小腸(十二指腸、空腸和回腸)絨毛高度、隱窩深度以及V/C值降低，并且導(dǎo)致杯狀細(xì)胞數(shù)量減少。這表明蛋氨酸缺乏時(shí)小腸正常發(fā)育會(huì)受到阻礙，其功能也會(huì)受損。