郭曼嵐，劉蔚雯，勾夢壯，劉亞偉，陳騰祥

1貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室//貴州省干細胞重點實驗室，貴州 貴陽 550009；南方醫(yī)科大學(xué)2第一臨床醫(yī)學(xué)院，3南方醫(yī)院神經(jīng)外科//精準(zhǔn)神經(jīng)外科實驗室，廣東 廣州 510515

膠質(zhì)瘤是成人中最常見的原發(fā)性腦腫瘤，平均無進展生存期僅6月[1-2]，表現(xiàn)出惡性侵襲性和不良預(yù)后[3]。手術(shù)聯(lián)合治療和化療是治療原發(fā)性膠質(zhì)瘤的主要治療方法[4]。目前，替莫唑胺（TMZ）是用作神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的一線治療藥物，但轉(zhuǎn)移性膠質(zhì)瘤治療方面進展甚微，主要是由于癌細胞對化療的抵抗[5-7]。因此，尋找一種新的藥物是迫切需要的?？灯杖鹜×姿徕c（CA4P）是一種微管蛋白結(jié)合的腫瘤血管破壞劑，對腫瘤血管系統(tǒng)顯示有效和選擇性毒性[8-9]。CA4P已經(jīng)過廣泛臨床試驗，且在使用多種模式的臨床前研究中進行了評估[10-11]，對多種惡性腫瘤具有抑制作用。有文獻報道，CA4P引起快速，暫時的腫瘤血管關(guān)閉，并導(dǎo)致大鼠腦腫瘤異種移植物中的腫瘤灌注減少[12]。在體外，CA4P增加臍帶靜脈內(nèi)皮細胞通透性，同時主要通過破壞VE-鈣粘蛋白/β-連環(huán)蛋白/Akt信號傳導(dǎo)途徑來抑制內(nèi)皮細胞遷移和毛細血管形成，從而導(dǎo)致快速血管崩解和腫瘤壞死[13]。同時，CA4P能夠體外抑制人早幼粒細胞，人非小細胞肺癌細胞，人肝癌細和，人宮頸癌細胞等的增值活性和影響人晶狀體上皮細胞增殖及遷移[14-16]。但是，對于CA4P作用膠質(zhì)瘤的體外研究很少。本研究將CA4P應(yīng)用于體外培養(yǎng)的人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87，表明CA4P的抗腫瘤作用主要是通過抑制增值和遷移，可為臨床化療用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質(zhì)瘤U87細胞購買自ATCC細胞庫。CA4P購自上海蒽桂生物科技有限公司，溶于二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）配制成10 mmoL/L保存液。DMEM，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco，胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國Hyclone。CCK-8試劑盒購自日本，DAPI購自美國ROCHE。E-Cadherin、GAPDH兔一抗和兔二抗、Path Scan Intracellular Signaling Array Kit購自于Cell Signaling Technology。

1.2 細胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤U87細胞常規(guī)復(fù)蘇后，貼壁培養(yǎng)在含10% FBS、100 U/L青霉素和鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)基中，放置在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8細胞活力檢測

取對數(shù)生長期的細胞消化鋪于96孔板中，5×103/孔。12 h后，分別用0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L CA4P刺激細胞。設(shè)置3個復(fù)孔，在分別刺激1、2、3、4、5 d后，吸棄原細胞上清，每孔加入110 μL（含10 μL cck-8試劑）培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nmol/L處的A值。得到的數(shù)值用SPSS 22.0統(tǒng)計并用graphpad軟件得到折線圖。

1.4 劃痕和transwell遷移實驗

取對數(shù)生長期的細胞消化鋪于6孔板中，3×105/孔，12 h后，用20 μL的槍頭在單層細胞上沿垂直方向呈“一”字劃痕，用PBS洗掉漂浮的細胞后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基（分別含0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L CA4P），培養(yǎng)24 h后用倒置顯微鏡下拍攝3個劃痕區(qū)域。細胞消化鋪105個于transwell小室中，上室為DMEM，下室含10%FBS的DMEM，12 h后細胞用甲醇固定5 min，晾干，DAPI染5 min，熒光顯微鏡下取6個視野拍照。

1.5 Western blot及pathscan檢測

將U87細胞鋪于10 cm培養(yǎng)皿，分別用0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L CA4P刺激24 h后，收集細胞總蛋白。用BCA法測定蛋白的濃度，制備10%SDSPAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后4℃孵育一抗過夜。TBST洗3遍，室溫孵育二抗1 h，TBST洗3遍，發(fā)光液進行顯影。使用Path Scan Intracellular Signaling Array Kit試劑盒檢測細胞信號通路。取對數(shù)生長期的U87細胞鋪于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，分別給予0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L的CA4P刺激24 h，按照Path Scan Intracellular Signaling Array Kit試劑盒說明書進行蛋白提取，孵育，于Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)進行顯影。

1.6 統(tǒng)計分析

用Image J軟件測量灰度值，所有的數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行兩個獨立樣本t檢驗分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計圖和折線圖用Excel軟件。

2 結(jié)果

2.1 CA4P抑制U87細胞增殖

CA4P作用U87細胞24內(nèi)，各組間U87細胞活力差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。24 h后，與對照組相比6.25、12.5、25、50、100 nmol/L的CA4P可以使細胞存活率降低（圖1）。

圖1 CA4P抑制U87細胞的增殖

2.2 CA4P抑制U87細胞遷移

細胞劃痕實驗表明CA4P作用U87細胞24 h后，各濃度組都能抑制細胞的遷移。其中，濃度為50、100 nmol/L時抑制最為顯著（圖2A）。Transwell實驗同樣表明，CA4P對U87細胞遷移能力的抑制作用并且具有濃度依賴性。CA4P隨著作用濃度的增加抑制作用逐漸增加，10 nmol/CA4P作用U87細胞24 h后可以顯著抑制細胞從上室穿過到下室（P＜0.001，圖2B、C）。

圖2 CA4P抑制U87細胞的遷移

2.3 CA4P使得U87細胞中E-Cadherin上調(diào)和通路激活

Western blot結(jié)果顯示，不同濃度的CA4P作用細胞后，EMT標(biāo)記蛋白E-Cadherin的相對表達水平隨著CA4P濃度的增加逐漸升高，呈濃度依賴性（圖3A）。Pathscan實驗證明，不同濃度CA4P刺激后與對照組相比Akt的Ser473位點磷酸化水平升高，但是濃度為100 nmol/L時磷酸化水平降低。Bad在Ser112位點磷酸化水平升高，但是濃度為100 nmol/L時磷酸化水平?jīng)]有顯著改變，50 nmol/LCA4P使得細胞中SAPK/JNK在THR183/TYR18位5和GSK-3β在SER9位磷酸化水平升高，而其它濃度刺激沒有顯著改變。S6 ribosomal protein的Ser235/236位點磷酸化水平降低，但是濃度為50 nmol/L時磷酸化沒有顯著變化（圖3B）。

圖3 不同濃度的CA4P作用U87細胞后E-Cadherin蛋白和細胞內(nèi)信號通路的變化

3 討論

迄今為止，膠質(zhì)瘤研究在基因分析水平取得了巨大進步。分子靶向藥物治療的Ⅲ期臨床試驗卻均告失敗，包括貝伐單抗也不能使患者明顯獲益。另外，由于膠質(zhì)瘤免疫原性不強，因此對某些腫瘤療效顯著的免疫療法如疫苗、抗體、嵌合抗原受體-T細胞治療都沒有明顯進展。CA4P作為一個在臨床研究中發(fā)現(xiàn)由于破壞血管而具有抗腫瘤活性作用的藥物，對膠質(zhì)瘤治療的突破存在潛在的可能性。所以，CA4P對抗膠質(zhì)瘤作用的機制探討的研究可以為CA4P對于膠質(zhì)瘤臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

癌發(fā)生是一個多步驟的過程，其中組織結(jié)構(gòu)的變化和腫瘤前結(jié)節(jié)的形成先于癌癥的出現(xiàn)[17]。這些改變與細胞表型的改變有關(guān)，包括上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細胞遷移，導(dǎo)致局部缺氧區(qū)域促進組織干細胞的存活和生長[18]以及血管生成，從而使得癌細胞不受控制的生長。缺乏正常的生長控制不僅在腫瘤早期發(fā)生而且在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起作用。因此，有許多研究需要研究如何以及何時開始異常生長，然后利用這些知識來確定新的治療靶點和方法。在以往的報道中，研究者發(fā)現(xiàn)CA4P可以抑制體外和體內(nèi)很多癌癥的活性[14-16]。但是，對于膠質(zhì)瘤，只報道過CA4P減少大鼠腦腫瘤的皮下移植瘤的血管灌注。CA4P作用膠質(zhì)瘤的體外研究很少。本研究的目標(biāo)是了解CA4P對膠質(zhì)瘤U87細胞的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA4P抑制U87細胞的增殖和遷移，U87細胞的遷移率隨著CA4P作用濃度的增加而下降，呈現(xiàn)濃度效應(yīng)。此外，隨著CA4P濃度的增加，細胞中E-Cadherin水平上調(diào)。許多的研究同樣證明E-Cadherin蛋白與細胞遷移有關(guān)。例如，有研究認(rèn)為原鈣粘蛋白7可以通過抑制E-Cadherin抑制細胞遷移[19]，也有研究認(rèn)為在前列腺癌中E-Cadherin蛋白表達上調(diào)抑制了細胞遷移[20]。

有關(guān)CA4P抑制細胞增殖的機制有各種報道。CA4P破壞線粒體膜電位，釋放促凋亡的線粒體膜蛋白和DNA片段化使得急性骨髓性白血病線粒體損傷。此外，CA4P通過下調(diào)粘附分子VCAM-1的表達來減少白血病細胞與新生血管的相互作用，從而增加白血病細胞死亡[21]。CA4P引起DNA片段化的G2/M周期阻滯，誘導(dǎo)凋亡和自噬標(biāo)記微管相關(guān)蛋白質(zhì)輕鏈3-II蛋白水平上調(diào)介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞程序性死亡。研究發(fā)現(xiàn)犬腫瘤組織來源的內(nèi)皮細胞中VE-cadherin的表達模式異常，VE-cadherin異常表達增加了細胞對CA4P的敏感性[22]。

本研究通過實驗發(fā)現(xiàn)CA4P抑制細胞增殖和遷移與細胞信號通路變化有關(guān)。CAP4刺激后S6 ribosomal protein的Ser235/236位點磷酸化水平降低。S6 ribosomal protein的下調(diào)顯著的抑制體外細胞的增殖，促進細胞在G0-G1期阻滯[23]。Akt磷酸化抑制Ser112處的促凋亡蛋白Bad和Ser9處的多功能激酶GSK-3β活性并促進細胞存活[24-26]。JNK被歸類為應(yīng)激激活的激酶，并被各種應(yīng)激物激活，包括氧化應(yīng)激和化療藥物。已發(fā)現(xiàn)JNK調(diào)節(jié)促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其在線粒體依賴性細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。Path Scan實驗研究發(fā)現(xiàn)用濃度為6.25、12.5、25、50 nmol/L的CA4P作用24 h，Akt上調(diào)，加大濃度為100 nmol/L時下調(diào)。以前已經(jīng)證實在人類癌癥中Akt磷酸化位點激活促進癌癥的發(fā)生發(fā)展[24，28]。但是，本研究在Path Scan實驗研究發(fā)現(xiàn)濃度為66.25、12.5、25、50 nmol/L的CA4P作用24 h，Akt上調(diào)，加大濃度為100 nmol/L時下調(diào)。這可能是CA4P介導(dǎo)信號通路間的互相調(diào)節(jié)，從而表現(xiàn)出不同劑量，主導(dǎo)細胞功能的信號通不同。

總之，CA4P抑制U87細胞的增殖和遷移和調(diào)控相關(guān)信號通路。某個信號通路的變化或者幾個信號通路間相互影響調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細胞增殖和遷移的機制是一個復(fù)雜的過程，需要進一步深入探究。