王 華，孫 娜，闞 威

(1.隴南師范高等?？茖W(xué)校，甘肅 隴南 742500；2.青海省動(dòng)物疫病 預(yù)防控制中心，青海 西寧 810000)

雞巴氏桿菌病又稱禽霍亂，是由多殺性巴氏桿菌(革蘭氏陰性菌)引起的傳染病， 以敗血癥和炎癥出血為主要示病特征[1]。 該病菌一般寄生在健康家禽的呼吸道中[2]，不引起感染，直至家禽機(jī)體抵抗力降低時(shí)， 細(xì)菌及毒素經(jīng)淋巴液進(jìn)入組織血液，引起內(nèi)源性感染[3]且多為暴發(fā)性感染，發(fā)病率和至死率較高。 根據(jù)該疾病暴發(fā)時(shí)臨床癥狀表現(xiàn)可分為： 最急性型、急性型和慢性型。最急性型常發(fā)生于流行初期，主要表現(xiàn)為雞沒有任何先兆的突然死亡，且以肥胖雞或高產(chǎn)蛋雞居多。 隨后即出現(xiàn)急性型病雞。 病雞發(fā)病快、死亡快，以敗血性經(jīng)過和劇烈下痢為主要特征，主要表現(xiàn)為體溫較正常雞的高2～4℃，因呼吸困難，繼而特征性癥狀是張口搖頭，因此也被稱之為“搖頭瘟”[4]。慢性型則主要多發(fā)生于疫病流行后期，通常表現(xiàn)為雞冠肉髯紅腫、并伴發(fā)有慢性呼吸道炎和胃腸炎，個(gè)別家禽會(huì)不同程度出現(xiàn)跛行、關(guān)節(jié)炎等癥狀。禽霍亂的發(fā)生無明顯的季節(jié)性，四季均可出現(xiàn)，但該細(xì)菌不耐受低溫，夏季發(fā)病率明顯高于冬季，家禽以7～10月齡為發(fā)病高峰，呈散發(fā)性或地方流行性[5]。

2017年7月底至8月初，青海省大通縣境內(nèi)某母養(yǎng)雞場(chǎng)1棟雞舍(10000羽)28只蛋雞突然死亡， 部分蛋雞陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁、雙翅耷拉、羽毛蓬松無光澤、小部分病雞關(guān)節(jié)腫大，跛行，雙趾外展，并伴有噼叉和行走困難等癥狀?；疾‰u少食甚至不飲不食，呼吸困難并伴隨腹瀉癥狀，排出灰白色或淡綠色稀糞，泄殖腔周圍羽毛污穢。剖檢頻死雞3只，僅見肺臟有出血，肝臟腫大，并可見條紋狀出血斑， 腎臟腫大較嚴(yán)重，其中1只雞脾臟腫大，關(guān)節(jié)腫大部位有類似結(jié)締組織贅生物。 剖檢已死亡雞2只，嗉囊無食物，極度消瘦。 剖檢出現(xiàn)急性死亡的病雞，可見心臟表面及內(nèi)膜覆蓋著米粒大小的出血點(diǎn)，心包膜變厚變硬，且內(nèi)有淡黃色積液充盈，腹膜微量出血，肝臟大而脆，并有灰白色出血點(diǎn)覆蓋。剖檢初步懷疑為雞馬立克氏病，但剖檢的5只雞均未見腹腔神經(jīng)叢、前腸系膜神經(jīng)叢、臂神經(jīng)叢和坐骨神經(jīng)叢病變， 可排除雞馬立可氏病，初步定性為禽霍亂。

為進(jìn)一步確診并控制疫情，青海省動(dòng)物疫控中心對(duì)病料進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷即細(xì)菌分離鑒定，并通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步確定。同時(shí)進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，以對(duì)大通縣境內(nèi)禽霍亂的藥物治療提供參考。

1 材料

1.1 主要試劑

本實(shí)驗(yàn)所用的試劑、來源見表1。

表1 試劑及來源

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明小鼠12只，6～8周齡，18～20g，SPF級(jí)，購(gòu)自青海大學(xué)。

1.3 病料

青海省西寧市大通縣某發(fā)病雞場(chǎng)。

2 方法

2.1 病料采集

按常規(guī)剖檢方法解剖病死雞5只，頻死雞3只，已死亡2只。分別編號(hào)雞1～5#,無菌條件下采集病變雞的脾臟(1p～5p)、肺臟(1f～5f)、腎臟(1s～5s)、肝臟(1g～5g)，4℃冷藏，帶回實(shí)驗(yàn)室，待檢測(cè)。

2.2 涂片鏡檢

在無菌條件下剪開雞1～5#的肝、脾、肺、腎，迅速將剪開的新鮮創(chuàng)面在玻片涂勻，形成一層薄凝固膜，酒精燈上部烘烤固定，干燥，制成觸片，分別瑞士和革蘭氏染色，鏡檢。

2.3 分離純化

無菌條件下，隨機(jī)選擇5組病死雞的心臟血和肝臟，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃，18～24h，觀察接種菌的增殖情況和菌落狀態(tài)，從中挑取一單個(gè)菌落革蘭氏染色鏡檢，做定性判斷。隨后挑取平板上的長(zhǎng)勢(shì)較好的濕潤(rùn)單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37℃增殖。之后取肉湯中的純培養(yǎng)菌分別劃線接種于TSA、麥康凱、三糖鐵、綿羊血瓊脂等培養(yǎng)基中，溫箱37℃，24h，觀察各培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)、菌落形態(tài)及溶血情況等，同時(shí)封存兩株分離菌，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

2.4 生化鑒定

取2.3中各培養(yǎng)基純化的巴氏桿菌2株于微量生化鑒定管，根據(jù)常規(guī)方法試驗(yàn)，觀察。

2.5 攻毒試驗(yàn)

取2.3中含有增殖細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯分別注射于小鼠(0.3mL/只)6只腹腔內(nèi)，無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯注射小鼠2只，作為對(duì)照。觀察小鼠發(fā)病死亡情況，立即剖檢死亡小鼠，取病變組織涂片、分離、純化、增殖、鑒定。

2.6 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)采用Kirby-Bauer法，取2.3肉湯中的增殖菌，并調(diào)整至濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?移液槍吸取調(diào)整好的菌液80μL，涂布棒平鋪于M-H上，1h后夾取藥敏紙片于培養(yǎng)基表面，倒置37℃，24h，游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑，參照杭州微生物試劑有限公司提供的藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)判定分離純化該雞場(chǎng)的禽巴氏桿菌對(duì)常用抗生素的敏感度。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 細(xì)菌形態(tài)與鏡檢結(jié)果

2.2中的涂片和觸片美藍(lán)染色，鏡檢，可見兩極濃染、兩端鈍圓的短桿菌；革蘭氏染色，鏡檢，細(xì)菌紅染，屬革蘭氏陰性短桿菌，散在或成對(duì)存在。

圖1 革蘭氏染色結(jié)果

3.2 細(xì)菌培養(yǎng)特性

將接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的禽巴氏桿菌生長(zhǎng)較好，菌落濕潤(rùn)光滑，乳白色，邊緣整齊，呈圓形或橢圓形，直徑約1mm，折光下，菌落邊緣可折射出微弱的淡藍(lán)色光；麥康凱培養(yǎng)基中菌落干燥，無增殖菌落出現(xiàn)，表示不生長(zhǎng)；在5%綿羊血瓊脂培養(yǎng)基中雖有濕潤(rùn)光滑的露珠狀小菌落再生，但無溶血環(huán)出現(xiàn)，表示不溶血。在三糖鐵培養(yǎng)基中有零星的小菌落出現(xiàn)，新鮮菌落數(shù)目較少，增殖不明顯且培養(yǎng)基底部顏色變黃，表示Fe3+部分被還原。

3.3 細(xì)菌生化鑒定

分離純化的禽巴氏桿菌其生化鑒定結(jié)果見表2，國(guó)外參考株的生化結(jié)果與分離株的生化結(jié)果無差異，符合多殺性巴氏桿菌的生化特點(diǎn)。

3.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果

用上述生化鑒定的同株菌對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。腹腔注射增殖菌的6只小鼠18h內(nèi)全部死亡，對(duì)照組小鼠均健康。解剖其中死亡的小鼠4只，均可見明顯的肺臟充血，干細(xì)胞大量的變質(zhì)壞死，并伴有出血，腸道呈卡他性病變。取死亡小鼠的心血涂片，革蘭氏染色鏡檢，視野內(nèi)充滿紅色短桿菌。

3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用購(gòu)置的20種藥敏紙片分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見圖2，表3。

表2 分離株生化鑒定結(jié)果

圖2 分離株藥敏實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株對(duì)頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿奇霉素、卡那霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、氟苯尼考均表現(xiàn)出高度敏感性，對(duì)氨芐西林、鏈霉素和恩諾沙星中度敏感，對(duì)紅霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶(TMP)均不敏感。兩菌株對(duì)慶大霉素、強(qiáng)力霉素(多西環(huán)素)、氧氟沙星、復(fù)方新諾明敏感性不一，XH-1對(duì)這4種藥物高敏感，但XH-2對(duì)慶大霉素表現(xiàn)為中度敏感，對(duì)其他3種藥物均不敏感(見圖2和表3)。

表3 分離株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3(續(xù))

注：S為敏感，I為中介，R為抗藥

4 討論

多殺性巴氏桿菌是限制畜牧業(yè)發(fā)展的重要病原菌，不僅引起禽類的大量死亡[6]，還可引起豬肺疫[7]，兔膿血癥[8]等疾病，而且可協(xié)同其他病原菌于人的呼吸道，引發(fā)敗血癥，威脅人類健康[9]。

本試驗(yàn)是從規(guī)?；酿B(yǎng)雞場(chǎng)突然發(fā)病而采集的病料，通過最基本的實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，獲得致病菌。通過參照《獸醫(yī)微生物學(xué)》[10]、《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室診斷手冊(cè)》[11]、《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[12]等教材的具體的表述進(jìn)行鑒定，革蘭氏和瑞士染色、鏡檢，根據(jù)不同培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)的不同特點(diǎn)、葡萄糖等生化試驗(yàn)的特異性鑒定，證明出分離培養(yǎng)純化的的細(xì)菌為禽多殺性巴氏桿菌。攻菌后的小鼠病理變化主要集中小鼠的消化系統(tǒng)，其中肝臟和小腸最為明顯。從肝臟和心臟血液中涂片染色的結(jié)果與雞場(chǎng)中采集的病死雞的肝臟和心臟血液觸片的鏡檢的細(xì)菌形態(tài)完全一致，并且分別培養(yǎng)的特性和生化鑒定的結(jié)果完全一致菌，表明本試驗(yàn)中分離的巴氏桿菌株具有較強(qiáng)的致病性?？咕幬镌诖舜晤A(yù)防禽霍亂疫病的蔓延發(fā)揮了重要的作用，但由于抗生素的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性較強(qiáng)，因此所造成的后果是給本病的防控和治療帶來了很大困難。從藥敏試驗(yàn)的結(jié)果可以看到，分離株所得的對(duì)試驗(yàn)中的20種藥物敏感性結(jié)果存在差異，分離株對(duì)紅霉素、四環(huán)素等藥物產(chǎn)生了耐藥性，根據(jù)詢問飼養(yǎng)人員，這可能與平日預(yù)防治療其他禽病所用的藥物種類和數(shù)量有關(guān)。使用頭孢他啶等高度敏感的藥物用于本病治療，同時(shí)配合每日2次新潔爾滅消毒，2周內(nèi)未有新的病例出現(xiàn)，使疫情得到控制，預(yù)防和治療效果較為顯著，高效。但是必須聲明的是:在頭孢他啶等高度敏感的藥物的使用時(shí)不可連續(xù)反復(fù)使用同一種藥物，可交替換藥或輪換用藥，根據(jù)不同的藥理學(xué)配伍和作用對(duì)癥下藥，與此同時(shí)必須嚴(yán)格控制用藥劑量，避免濫用抗生素。

禽霍亂疫情的發(fā)生可使家禽易感染，并且具有較高的死亡率高，因此在家禽的養(yǎng)殖過程中一定要注意該疾病的防控，并且嚴(yán)格控制種內(nèi)種間的傳染。對(duì)于規(guī)模化的養(yǎng)殖場(chǎng)，特別是養(yǎng)雞場(chǎng)要做好預(yù)防工作。目前我國(guó)雞巴氏桿菌病疫苗主要是菌苗，但禽巴氏桿菌血清型多(16種)、交叉免疫力低，導(dǎo)致疫苗免疫效果不理想[11]。因此，從本養(yǎng)殖場(chǎng)病死雞中分離雞多殺性巴氏桿菌制成菌苗或基于其毒力因子外膜蛋白(OMP)制成亞單位疫苗，較傳統(tǒng)的疫苗具有明顯的特異性和靈敏性[13]，對(duì)本養(yǎng)殖場(chǎng)巴氏桿菌病的預(yù)防效果較好，但還未得到推廣。由于禽霍亂的致病菌屬于條件性致病菌，在高溫、潮濕、飼養(yǎng)管理不當(dāng)、飼養(yǎng)衛(wèi)生較差、通風(fēng)不良等外界環(huán)境較差的誘因下促進(jìn)本病的發(fā)生。因此，飼養(yǎng)人員必須嚴(yán)格做好日常環(huán)境消毒、給予家禽全價(jià)飼料，及時(shí)補(bǔ)充蛋白質(zhì)和維生素，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、增強(qiáng)雞體自身的免疫力才是預(yù)防本病的最重要的措施。