趙慧君，董蘊，劉偉，胡事成，郭壯*

(1.湖北文理學院食品科學技術(shù)學院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市食品藥品檢驗所，湖北 襄陽 441021；3.湖北襄陽孔明菜食品有限公司，湖北 襄陽 441104)

湖北襄陽大頭菜是湖北襄陽的農(nóng)家品種[1]，更是我國四大名腌菜之一。襄陽大頭菜歷史悠久，為諸葛亮隱居襄陽隆中時所創(chuàng)，在民間享有“諸葛菜”、“孔明菜”之美稱[2]。但是襄陽大頭菜的生產(chǎn)總體處于粗放式加工狀態(tài)，由于雨水和塵土等因素的影響，腌制池或缸表面會形成一層白色的生物膜。隨著生物膜的出現(xiàn)，大頭菜的脆度明顯降低且產(chǎn)生刺激性氣味，最終導致產(chǎn)品品質(zhì)下降直至失去經(jīng)濟價值。

目前關(guān)于食品中微生物的研究多集中在傳統(tǒng)純培養(yǎng)手段。胡懷容等[3,4]從袋裝腐敗的大頭菜中分離微生物進行純培養(yǎng)，分離出7株細菌和2株酵母菌，并對其生理特性進行了研究。饒瑜等[5]對泡菜生物膜中真菌進行分離，研究表明Pichiakluyveri和Geotrichumcandidum是導致生物膜形成的主要原因。值得一提的是，徐婷等[6]使用YPD培養(yǎng)基，采用純培養(yǎng)的方法從長有生物膜的襄陽大頭菜鹵水中分離了1株嗜鹽酵母菌，并將其鑒定為Zygosaccharomycesrouxii。葡萄酒發(fā)酵過程中也會出現(xiàn)生物膜，Volleková等[7]采用純培養(yǎng)的方法從紅酒的表面生物膜中分離到4株酵母菌；Sergio等[8]從巴西葡萄酒中分離得到了6個種的酵母菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其均可以在不同的碳源下形成生物膜。

本研究對長膜襄陽大頭菜醬液中的微生物多樣性進行了研究，不僅能夠了解可能導致襄陽大頭菜長膜的微生物組成和種類，亦可為后續(xù)因形成生物膜而導致大頭菜產(chǎn)品品質(zhì)下降這一產(chǎn)業(yè)化問題的解決提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本試驗所用材料采集于襄陽孔明菜食品有限公司。分別在3個正常發(fā)酵大頭菜池和3個長膜的大頭菜池里采集醬液和生物膜，采集后低溫保存，帶回實驗室進行后續(xù)試驗。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

PDA固體培養(yǎng)基：北京博奧星生物技術(shù)有限公司；蛋白胨、酵母提取物：英國OXOID公司；葡萄糖：天津福星化學試劑廠；瓊脂粉：上海國藥集團；DNA Marker：Fermentas公司；PCR清潔試劑盒(AXYGEN)：購于北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2×PCR Mix：購于南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、dNTP、pMD18-T vector：購于大連寶生物技術(shù)有限公司(TaKaRa)；PCR引物的合成和測序：由武漢天一輝遠生物科技有限公司完成。

1.3 樣品中酵母菌的分離與純化

在無菌條件下分別將正常發(fā)酵大頭菜醬液和長膜大頭菜醬液用生理鹽水進行稀釋，稀釋梯度分別為10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，每個梯度各取0.5 mL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下培養(yǎng)1天左右。取長出的單菌落劃線，純化2次，進行形態(tài)觀察和鏡檢，將純化后的菌株保存在-80 ℃冰箱中待用。

1.4 酵母菌基因組DNA的提取及檢測

采用消解酶-氯化芐法提取酵母菌DNA[9]，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行檢測。

1.5 酵母菌28S rDNA基因的PCR擴增

以所提取的大頭菜酵母菌總DNA為模板進行分離菌株D1/D2可變區(qū)基因的PCR擴增，引物為NL1和NL4(序列見表1)[10]。PCR擴增體系為2.5 μL10×PCR Buffer(含Mg2+)，2 μL dNTP(2.5 mol/L)，0.5 μL NL1(10 mmol/L)，0.5 μL NL4 (10 mmol/L)，0.5 μL rTaq(5 U/μL)，1 μL DNA模板，18 μL無菌水。PCR反應條件：95 ℃ 4 min預變性，95 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴增結(jié)束，取擴增產(chǎn)物5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers' names and sequences

1.6 PCR產(chǎn)物的純化、克隆及測序

將擴增成功的PCR產(chǎn)物進行純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T vector連接并轉(zhuǎn)化，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落進行PCR鑒定，所用的引物為M13F(-47)和M13R(-48)。PCR擴增體系為10 μL 2×PCR Mix，0.5 μL M13F(-47)(10 mmol/L)，0.5 μL M13R(-48)(10 mmol/L)，1 μL菌液為模板，8 μL無菌水。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR結(jié)束后用1%的瓊脂糖進行凝膠檢測。陽性克隆送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

1.7 測序產(chǎn)物的比對及進化樹構(gòu)建

將測序結(jié)果除去兩端載體序列，然后利用NCBI Blast從GenBank數(shù)據(jù)庫中提取相似度比較高的相似序列，用MEGA 4.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-joining(鄰位相連法)制作系統(tǒng)進化樹[11]，利用Bootstrap(自展法)檢測制作的系統(tǒng)樹[12]，自展數(shù)據(jù)集為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌菌落形態(tài)觀察

從正常發(fā)酵大頭菜醬液(標號為N)中和長膜大頭菜醬液(標號為M)中共20株酵母菌株培養(yǎng)于YPD液體培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)1天，肉眼觀察菌落形態(tài)為：部分試管內(nèi)溶液澄清，表面無膜生成，底部沒有沉淀；部分試管液體表面有膜形成，底部有沉淀存在，溶液有一定程度的渾濁。將20株酵母菌劃線在PDA瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1天，菌落形態(tài)為：菌落顏色呈乳白色；菌落從側(cè)面觀察有凸起也有扁平，表面粗糙有褶皺，也有表面光滑；菌落邊緣有長出毛邊，也有呈現(xiàn)鋸齒狀，或者整齊無邊。分離菌株菌落形態(tài)觀察結(jié)果匯總?cè)氡?，菌落形態(tài)見圖1。

表2 菌落形態(tài)觀察Table 2 Observation of colonial morphology

續(xù) 表

圖1 酵母分離菌株在PDA上的培養(yǎng)Fig.1 Culture of yeasts isolated strains on PDA

2.2 顯微鏡下大頭菜分離菌株的觀察結(jié)果

分離到的20株酵母菌用結(jié)晶紫染色后進行鏡檢，在顯微鏡下可以看到分離菌株的細胞形態(tài)：存在桿狀，球狀，橢圓形，見圖2。

圖2 大頭菜分離菌株在顯微鏡下的細胞形態(tài)(10×100)Fig.2 Cell morphology of strains isolated from mustard root under microscope (10×100)

2.3 酵母菌的DNA提取及28S rDNA擴增

提取的酵母菌DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后為單一條帶，無拖尾。說明提取的DNA完整無降解，可用于下一步酵母菌28S rDNA的PCR擴增。擴增結(jié)束后，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在650 bp左右位置有一條明亮清晰的條帶，與目的條帶相符。將PCR產(chǎn)物進行純化與T-A克隆，并將陽性克隆送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。

2.4 NCBI比對結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

大頭菜20株酵母分離菌株經(jīng)28S r DNA D1/D2區(qū)測序后，將結(jié)果在NCBI用Blast進行比對，具體對比結(jié)果及序列相似性見表3。

表3 分離菌株的比對結(jié)果Table 3 Comparison results of the isolated strains

由表3可知，除了Cystobasidiumcalyptogenae(FJ515245)只有94%相似度(可能為新種，目前實驗室正在進行驗證)，其他分離菌株相似度≥99%。從3份正常發(fā)酵襄陽大頭菜醬液中分離出13株酵母菌，其中2株Zygosaccharomyces屬，3株Cystobasidium屬，3株Erythrobasidium屬，2株Acremonium屬，1株Rhodotorula屬，1株Bulleromyces屬，1株Issatchenkia屬。從3份長膜襄陽大頭菜醬液中共分離出7株酵母菌，其中5株Zygosaccharomyces屬，1株Yamadazyma屬，1株Rhodotorula屬。

根據(jù)20株酵母菌在NCBI上的比對結(jié)果選取相似度高的已知序列菌株，利用MEGA 4.0做出系統(tǒng)發(fā)育樹，找出待測菌株與已知酵母種屬菌株的關(guān)系。

2.5 正常發(fā)酵大頭菜與長膜大頭菜醬液中酵母菌的比較

圖3 28S rDNA D1/D2 區(qū)域序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 28S rDNA D1/D2 region sequence

20株酵母菌中7株是從長膜大頭菜醬液中分離的，13株是從正常發(fā)酵大頭菜醬液中分離的。長膜大頭菜醬液中分離的酵母菌5株屬于Zygosaccharomyces屬，占總分離菌株的71.4%，為長膜大頭菜中酵母菌的優(yōu)勢菌屬，其中3株在培養(yǎng)1天后可以看到在YPD培養(yǎng)基的表面長膜，推測可能是引起大頭菜長膜的酵母菌株。泡菜中也存在長膜的現(xiàn)象，俗稱“生花”。從泡菜中分離的腐敗真菌主要為畢赤酵母(Pichiamembranefaciens)[13,14]，這與襄陽大頭菜中分離的酵母是不同的，兩者的腐敗機制可能存在著差異，需要進一步的試驗驗證。正常發(fā)酵大頭菜醬液中13株酵母菌屬于9個屬，多樣性高于長膜大頭菜醬液。Zygosaccharomyces屬菌株也存在于正常發(fā)酵大頭菜醬液中，占分離菌株的15.3%，非優(yōu)勢菌株。

3 結(jié)論

本研究分別從3份正常發(fā)酵大頭菜醬液和3份長膜大頭菜醬液中進行了酵母菌的分離，共分離20株菌。通過28S rDNA D1/D2可變區(qū)同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，20株菌屬于10個屬2個門。從比對結(jié)果可以看出，正常發(fā)酵大頭菜醬液中的酵母菌多樣性高于長膜大頭菜醬液，其中長膜大頭菜醬液中的優(yōu)勢菌屬為Zygosaccharomyces，推測是引起大頭菜醬液長膜的酵母菌屬。

在泡菜和肉類的腐敗過程中，細菌起到了重要的作用[15-17]，但是在襄陽大頭菜中細菌對大頭菜長膜的貢獻目前還沒有人研究，這是本實驗室下一步要進行的工作。