王 虔

(沈陽急救中心，遼寧 沈陽 110000)

內皮祖細胞(EPCs)是一類可以分化為成熟內皮細胞(ECs)的前體細胞,來源于骨髓、胎兒肝臟、臍帶血等，存在于骨髓、外周血及肝臟中〔1〕。組織缺血可造成局部缺氧進而造成損傷，因此其修復需要改善局部血運。本實驗觀察低氧對內皮祖細胞的遷移影響，討論其改善局部血運的可能。

1 材料與方法

1.1主要材料 SD大鼠(體重150～180 g)、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、M199培養(yǎng)液、內皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、堿性纖維細胞因子(bFGF)、Percoll淋巴細胞分離液(天津灝洋)；anti-CD133/PE、anti-CD34/PE(BD公司)；SABC免疫組織化學試劑盒 (武漢博士德)等。

1.2EPCs的分離誘導培養(yǎng) 取SD大鼠四肢長骨，剔除殘余肌肉組織，直接用PBS沖出骨髓，將沖出的骨髓液收集在帶刻度的離心管中，密度梯度離心法分離出單個核細胞(白色絮狀物層)，重懸在含有胎牛血清及VEGF、bFGF、凝集素表皮生長因子結構域的共同區(qū)域(LEGF)的M199 培養(yǎng)基中，并將含細胞培養(yǎng)液接種在預先包被人纖維連接蛋白(HFN)的培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后首次換液，留取貼壁細胞進行培養(yǎng)，以后每隔3～4 d換液1次。當細胞融合達到約80%時可傳第1代，以后每8～10 d可傳1代。

1.3EPCs的鑒定 ①通過觀察細胞形態(tài)進行鑒定:在倒置相差顯微鏡下，觀察細胞的生長情況及形態(tài)學變化，與內皮祖細胞形態(tài)特點進行對比并加以鑒定;②流式細胞檢測:獲取培養(yǎng)的第3代細胞，將其制成濃度為1×106/ml的細胞懸液,然后向細胞懸液分別加入10 μl FITC標記的CD34抗體、R-PE標記的VEGFR2抗體,避光孵育30 min。使用流式細胞儀分析EPCs表面特有的標志,細胞以同型的R-PE染色作為陰性對照。CD34(+)、CD133(+)、VEGFR-2(+)的細胞被認為符合EPCs特征。

1.4ELISA檢測不同條件下 SDF-1 的表達情況:實驗分組：A組(常氧組)：21%O2,25%CO2,74%N2;B組(低氧6 h組)：1%O2,5%CO2,94%N2;C組(低氧12 h組)：1%O2,5%CO2,94%N2;D組(低氧24 h組)：1%O2,5%CO2,94%N2;各組培養(yǎng)后取上清液，ELISA檢測基質細胞衍生因子(SDF)-1濃度。

1.5免疫熒光檢測SDF-1 的表達 分別取出以收集的常氧和低氧6、12、24 h 的細胞涂片，PBS 沖洗兩次，染色步驟嚴格按熒光試劑盒說明書操作，以SDF-1 為一抗。染色結果SDF-1 為胞質和胞膜發(fā)綠色熒光(FITC)為陽性。

1.6Transwell檢測低氧對EPCs遷移的影響 用含0.02%EDTA胰蛋白酶消化貼壁的EPCs并制成單細胞懸液。并將EPCs以1×105/ml濃度的重懸于含1%FBS的M199培養(yǎng)基中，小室下層分別加入600 μl A、B、C、D四組的細胞懸液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。24 h后從培養(yǎng)箱中取出小室,棉簽擦去小室上層膜的細胞，多聚甲醛固定，DAPI染色,通過計算染色數(shù)目可計算遷移細胞數(shù)量。在熒光顯微鏡下觀察濾膜外側面的染色細胞數(shù)量。100倍鏡下隨機8個視野進行計數(shù),取平均值。

1.7統(tǒng)計學方法 采用 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1光鏡下觀察細胞的形態(tài) EPCs通常于接種后2～3 d開始貼壁。接種后第4天，可見細胞團聚呈“集落”樣；接種后2 w，可見細胞成“鵝卵石”樣改變，見圖1。

2.2流式細胞儀檢測結果 CD34陽性率為(53.21±5.14)%,CD133陽性率為(50.33±6.08)%,VEGFR-2陽性率為(55.07±4.16)%。

2.3ELISA 檢測不同條件下 SDF-1 的表達情況 A組EPCs培養(yǎng)液上清SDF-1濃度(203.6±5.3)ng/L，B組濃度為(392.7±3.4)ng/L，C組濃度(619±5.8)ng/L，D組濃度為(469.1±6.6)ng/L。與常氧對照組比較，低氧6、12、24 h 誘導 HIF-1α 的表達,6 h 表達開始增強，12 h 表達最強，24 h 又有所減弱(P<0.01)；低氧12 h與低氧6、24 h差異明顯比較(P<0.01)。

2.4免疫熒光檢測SDF-1 的表達 與A組比較，低氧 6 h 表達開始增強，12 h 表達最強，24 h 又有所減弱。因SDF-1 為胞質和胞膜表達，F(xiàn)ITC 為綠色熒光。見圖2。

2.5Transwell檢測低氧對EPCs遷移的影響 A組EPCs穿過濾膜數(shù)為(29.0±1.2)個，B組為(47.2±2.1)個，C組為(61.7±1.6)個，D組為(39±0.9)個。 A組分別與B組、C組、D組比較差異顯著(P<0.05)；C組與B組、D組比較差異顯著(P<0.05)。見圖3。

圖1 EPCs形態(tài)學觀察(×100)

圖2 免疫熒光檢測SDF-1表達

圖3 Transwell檢測低氧對EPCs遷移的影響(×200)

3 討 論

EPCs是一類能夠在特定條件下定向增殖分化為成熟血管內皮細胞(EC)的前體細胞〔1〕。1997年，當EPCs首次被提出后〔2〕，15年的時間內，人們對血管再生及修復過程有了全新的認識。EPCs主要存在于骨髓至中，正常情況下僅占外周循環(huán)血的0.01%〔3〕。當局部缺血、缺氧造成器官受損或生理性需要血管新生時,局部組織通過釋放多種細胞因子,生長因子及激素等物質促進骨髓中的EPCs向外周動員〔4～8〕。當干/祖細胞受到外界影響與骨髓基質細胞分離，到達作用部位，稱為EPCs 的動員和歸巢〔9,10〕。同年Aiuti首次發(fā)現(xiàn)SDF-1是CD34+干細胞的趨化因子，提出CD34+可能按照SDF-1的濃度梯度進行遷移的結論，這為干細胞在骨髓和外周血之間的遷移提出了一個新的可能機制〔11～13〕。本實驗所得細胞符合內皮祖細胞特點〔14，,15〕。因此，本文得出結論，低氧可以促進EPCs分泌SDF-1，并動員外源性EPCs按照濃度梯度遷移。根據(jù)此結論，我們認為，應用外源性EPCs可以促進缺血缺氧部位組織的血管化，改善缺血缺氧狀態(tài)，進而進行組織修復。隨著對EPCs的研究逐步增加以及對低氧造成EPCs趨化作用的認識，人們更注重于將EPCs與治療缺血缺氧性疾病聯(lián)系起來。但是目前仍有一些問題有待解決，如EPCs的局部濃聚是否會形成血管瘤等帶來一定副作用。雖然這些問題尚未解決，但是EPCs對缺血缺氧性疾病的治療一定具有重要意義。