黃 河 魏 童 高文彪

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830011)

伊立替康是喜樹(shù)堿衍生物，在機(jī)體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兴幚砘钚缘拇x產(chǎn)物。伊立替康和其代謝產(chǎn)物廣泛分布在肝臟和腸道〔1〕，其活性代謝產(chǎn)物與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ相互作用，通過(guò)阻斷酶與DNA結(jié)合影響DNA 復(fù)制，形成無(wú)法逆轉(zhuǎn)的DNA雙鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞死亡〔2〕。此外，對(duì)于多重耐藥的癌細(xì)胞系也有部分活性〔3〕。然而，惡性結(jié)腸癌細(xì)胞仍有可能通過(guò)DNA損傷引起基因突變，或通過(guò)激活其他保護(hù)機(jī)制例如細(xì)胞自噬，對(duì)伊立替康耐藥〔4〕。

腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制并不十分清楚，p38與細(xì)胞類型、癌癥分期、活化程度有關(guān)〔5〕。有研究提出，p38通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞存活信號(hào)防止過(guò)早凋亡，并對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，扮演著保護(hù)細(xì)胞的重要角色〔6〕。激活的p38可以引起炎性細(xì)胞因子和酶的表達(dá)，促進(jìn)血管生成與腫瘤轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌組織中，p38α是細(xì)胞增殖和生存所必需的，抑制p38α將導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞凋亡或自噬性細(xì)胞死亡〔7，8〕。

本研究考察了不同濃度的伊立替康對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620凋亡的影響，探討p38在伊立替康誘導(dǎo)結(jié)腸癌凋亡過(guò)程中的作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人類結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620購(gòu)自ATCC公司；伊立替康購(gòu)自pfizer公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO)、DAPI、碘化丙啶(PI)、p38特異性抑制劑SB 203580購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、SignalSilence?p38 MAPK siRNA試劑盒購(gòu)自CST公司。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo Fisher 公司，其他試劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人類結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620。在溫度為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。每周2次傳代2次，待細(xì)胞密度超過(guò)90%后使用0.05%胰蛋白酶消化，操作過(guò)程確保無(wú)菌。使用DMSO作為稀釋劑配制SB 203580原液。SB 203580(10 μmol/L)溶液在伊立替康前20 min加入細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.2MTT法檢測(cè)伊立替康對(duì)SW620細(xì)胞的毒性作用 將結(jié)腸癌細(xì)胞SW620接種于96孔板中，用不同濃度的伊立替康處理，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的存活情況。用磷酸鹽緩沖液(PBS)小心沖洗2～3遍，然后加入10 μl 5 mg/ml MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入150 μl DMSO，在搖床上低速振蕩15 min，使結(jié)晶物能夠充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔的吸光度值。

1.2.3ELISA測(cè)定p38 活性 伊立替康處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞通過(guò)離心收集上清，所有細(xì)胞分組的預(yù)處理和p38活性測(cè)定按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。對(duì)不同樣品進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制p38和磷酸化p38的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以磷酸化p38與同一樣品中的總p38的比值作為p38活性指標(biāo)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 使用碘化丙啶染色對(duì)不同濃度伊立替康處理的結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)行定量。細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，用 PBS洗滌，離心去PBS，用預(yù)冷的70%乙醇在4℃固定2 h。沖洗后細(xì)胞重懸于含0.1% Triton X-100、50 μg/ml RNaseA和0.5 μg/ml碘化丙啶的溶液中，避光孵育30 min。通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞樣本中的凋亡比率。

1.2.5siRNA實(shí)驗(yàn) 使用SignalSilence?p38 MAPK siRNA試劑盒(Cell Signaling Technology公司)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟操作，特異性沉默p38 MAPK的表達(dá)。細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后，加入伊立替康作用并觀察細(xì)胞的增殖和凋亡情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)的比較。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度伊立替康對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620生長(zhǎng)的抑制作用 伊立替康抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，與其濃度和時(shí)間有關(guān)，呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1，圖2。

2.2伊立替康誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡 10、20 μmol/L伊立替康并不能顯著引起結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡〔細(xì)胞凋亡率為(5.47±1.23)%，(9.23±1.57)%〕，直到濃度增加至40、80 μmol/L，導(dǎo)致細(xì)胞顯著凋亡增加〔細(xì)胞凋亡率分別為(20.83±2.51)%，(41.25±2.49)%〕，100 μmol/L伊立替康作用于SW620細(xì)胞后凋亡率升至(49.37±2.35)%與空白對(duì)照組(0%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3p38 在伊立替康誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡過(guò)程中的活性變化 40 μmol/L伊立替康處理 SW620細(xì)胞，p38的激活相對(duì)較為緩慢；伊立替康作用24 h后，p38活性明顯增加并且不斷提高直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(48 h)。然而，100 μmol/L伊立替康處理SW620細(xì)胞過(guò)程中，p38活性在約 12 h內(nèi)急劇升高，達(dá)到峰值，接著慢慢地減弱直到試驗(yàn)結(jié)束。值得注意的是，在作用48 h后，p38 活性幾乎達(dá)到基底水平。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度伊立替康處理SW620 細(xì)胞不同時(shí)間后存活細(xì)胞比例

相同時(shí)間，不同濃度組間比較：1)P<0.05

圖1 不同濃度伊立替康作用于SW620 細(xì)胞24 h后的電子顯微照片(×10 000)

圖2 0 μmol/L和40 μmol/L伊立替康分別作用于SW620細(xì)胞0、24、48、72 h的電子顯微照片(×10 000)

時(shí)間(h)40 μmol/L100 μmol/L0100.00100.002104.13±6.86104.02±6.744105.94±7.65109.92±7.768106.67±7.68117.68±8.1912108.56±7.69137.87±14.232)16115.78±7.931)132.67±13.562)24121.46±9.371)128.35±10.892)36126.83±9.761)118.76±8.8648133.75±13.891)110.23±7.84

與0、2、4、8、12 h比較：1)P<0.05;與0、2、4、8、36、48 h比較：2)P<0.05

2.4p38 MAPK通路在伊立替康誘導(dǎo)SW620細(xì)胞凋亡中的作用 使用化學(xué)抑制劑 SB203580及siRNA干擾技術(shù)特異性抑制p38的表達(dá)，然后給予伊立替康處理細(xì)胞，結(jié)果表明兩者均能使p38 MAPK信號(hào)通路的活性顯著降低。兩種方法聯(lián)用會(huì)導(dǎo)致p38幾乎完全失活。見(jiàn)表3。

當(dāng)p38 MAPK的活性被抑制時(shí)，用40 μmol/L伊立替康處理結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SW620細(xì)胞凋亡明顯增加，并且在48 h后達(dá)到峰值。此外，40 μmol/L伊立替康作用24 h后，與對(duì)照組比較，存活細(xì)胞百分比顯著降低。100 μmol/L伊立替康處理組則表現(xiàn)出相反的效應(yīng)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，p38活性被抑制后，加入伊立替康作用不同時(shí)間，SW620細(xì)胞凋亡減少，同時(shí)存活細(xì)胞百分比明顯增加，特別是在24 h和48 h之間的時(shí)間段。見(jiàn)表4、表5。

表3 加入抑制劑SB203580 或轉(zhuǎn)染p38 siRNA后p38的活性變化

與伊立替康組比較：1)P<0.05

表4 p38活性被抑制后，40 μmol/L伊立替康處理SW620細(xì)胞不同時(shí)間，細(xì)胞的凋亡、存活比例

與同組其他時(shí)間點(diǎn)比較：1)P<0.05；下表同

表5 p38活性被抑制后，100 μmol/L伊立替康處理SW620細(xì)胞不同時(shí)間，細(xì)胞的凋亡、存活比例

3 討 論

有研究報(bào)道伊立替康及其他抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物在多種惡性腫瘤細(xì)胞中會(huì)激活 p38 MAPK〔9，10〕。 p38信號(hào)似乎與抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL有關(guān)，隨著DNA損傷，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)增加〔11〕。另一方面，p38 還可能通過(guò)直接激活 p53〔12〕或通過(guò)控制轉(zhuǎn)錄〔13〕來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。因此，在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑治療惡性腫瘤的過(guò)程中，p38對(duì)細(xì)胞存活和凋亡有至關(guān)重要的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，伊立替康激活相關(guān)信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且具有劑量依賴性。此外，在伊立替康治療結(jié)腸癌的體外模型中驗(yàn)證了p38 MAPK信號(hào)通路的潛在作用。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，伊立替康抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，呈劑量和時(shí)間依賴性，且濃度在 40 μmol/L出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示較低濃度伊立替康作用12 h，p38活性繼續(xù)穩(wěn)步增加，同時(shí)發(fā)生有限的細(xì)胞凋亡。當(dāng)p38的活性被抑制后，給予伊立替康作用12 h，細(xì)胞凋亡明顯增加，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(48 h)。在此濃度下，p38的活性和細(xì)胞凋亡之間有直接的因果關(guān)系。此外，p38 MAPK信號(hào)通路被抑制的細(xì)胞組，細(xì)胞存活率也相應(yīng)降低。有研究提出在癌細(xì)胞中p38信號(hào)代表了早期應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞有時(shí)間來(lái)評(píng)估損傷程度，進(jìn)行修復(fù)〔14〕。在結(jié)腸癌細(xì)胞中p38具有潛在控制自噬的保護(hù)性作用〔15〕。以熱休克蛋白(Hsp)27表達(dá)增加為例可以推斷，隨著p38活性緩慢而持續(xù)地增強(qiáng)，激活了特定的自我保護(hù)機(jī)制，一定程度上抑制了細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)〔16〕。另一方面，隨著高劑量伊立替康治療導(dǎo)致p38活性快速增加，存活信號(hào)可能切換為細(xì)胞凋亡信號(hào)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。當(dāng)給予抑制劑SB203580 或siRNA沉默p38的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞凋亡明顯減少，同時(shí)細(xì)胞存活率也相應(yīng)提高。p38可能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡前體蛋白的表達(dá)，如死亡受體、Fas及其配體FasL及Bax、Bcl-2家族的Bim或Noxa〔17，18〕，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。已知p38關(guān)聯(lián)多種凋亡途徑的表達(dá)或活性，如c-FLIP，Bcl-2，ERKs和Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔19，20〕。p38也有可能通過(guò)促進(jìn)線粒體凋亡信號(hào)活性導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔21〕。所以，關(guān)于p38 MAPK在伊立替康治療結(jié)腸癌過(guò)程中扮演的角色仍需進(jìn)一步研究?？傊?，伊立替康處理SW620 結(jié)腸癌細(xì)胞過(guò)程中激活p38通路，呈劑量依賴性。低劑量伊立替康誘導(dǎo)p38 活性緩慢增長(zhǎng)，從而激活生存機(jī)制，如Hsp27表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。相反，較高劑量伊立替康可導(dǎo)致 p38 活性迅速增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。