楊 庚 李 昱 賀亞峰

(西安市武警工程大學(xué)醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710086)

結(jié)腸癌在大多數(shù)國家的發(fā)病率呈上升趨勢〔1～3〕，資料顯示世界上新患結(jié)腸癌約120萬例/年，而死于此病的約60萬例/年〔4～6〕，結(jié)腸癌患者5年生存率仍然少于10%〔7〕。目前miRNA(miR)與腫瘤的相關(guān)性研究已成為熱點〔8〕。miR與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其細(xì)胞凋亡增殖等相關(guān)機制的調(diào)控有關(guān)〔9〕，由20～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA〔10〕，能與靶基因 3′非翻譯區(qū)域的結(jié)合位點互補或不完全互補，促進(jìn)其mRNA 降解或抑制翻譯參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等多個生物學(xué)過程〔11〕。多項研究證實不同差異的miR存在于結(jié)腸癌中〔12,13〕。而文獻(xiàn)指出在結(jié)腸癌高表達(dá)的一類miR就是miR-19a〔14～16〕。miR-17-92是首個被發(fā)現(xiàn)的非編碼致癌基因族〔17〕，該家族包括6個成員：miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92a〔18〕。其中miR-19在多種癌癥中高表達(dá),使其凋亡能力減低〔19,20〕。上調(diào)miR-19使細(xì)胞增殖和惡變作用加強，是通過抑制B細(xì)胞淋巴瘤中抑癌基因同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)的表達(dá)途徑實現(xiàn)的〔21〕。源于各種組織的miR表達(dá)譜可能存在差別〔19,22〕，當(dāng)檢測到異常的miR時，可根據(jù)其表達(dá)譜對多種低分化腫瘤進(jìn)行分類〔15,23〕，它還與細(xì)胞周期的調(diào)控〔24〕及治療時藥物的敏感性相關(guān)〔25〕,由此可見miR對結(jié)腸癌的三級預(yù)防及防止復(fù)發(fā)等方面的用途值得深入探究。本文探討miR-19a對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖凋亡及其侵襲力的作用。

1 材料與方法

1.1材料 結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，由陜西省醫(yī)學(xué)實驗動物中心實驗室冷凍保存。胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)；0.25%胰酶(Hyclone公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen,美國)；miR-19a模擬物、抑制物(GenePharma,上海)； CCK8試劑盒(上海和元生物)；碘化丙啶(PI)試劑盒(美國BD公司)；侵襲小室(Sigma 公司)； 人工基質(zhì)膠(南方醫(yī)科大學(xué)研究所)。

1.2結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞體外培養(yǎng)建立實驗?zāi)Ｐ图胺纸M 實驗?zāi)Ｐ徒ⅲ簝龃嬗谝旱械腖oVo細(xì)胞復(fù)蘇后，在5%二氧化碳(CO2)、濕度飽和的條件下，并將箱內(nèi)溫度設(shè)為37℃，DMEM培養(yǎng)液中加入100 μg/ml鏈霉素和100 μg/ml青霉素及10%滅活胎牛血清，然后進(jìn)行培養(yǎng)，注意在培養(yǎng)液有變化時換液。細(xì)胞長滿瓶底70%～80%時傳代一次。細(xì)胞傳代后棄掉全部培養(yǎng)液，加入適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)將其清洗干凈，導(dǎo)出,加入0.25%胰酶37℃消化2～3 min。當(dāng)鏡下發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙擴大時，為停止其消化需要加入DMEM培養(yǎng)基。待用工具反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液后，1 000 r/min離心5 min，倒掉上清液。用新的含10%血清的DEME重懸細(xì)胞，接種在新的培養(yǎng)板中，取對數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞為實驗細(xì)胞，將其鋪于6孔板中，即為實驗?zāi)Ｐ?。實驗分組：轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物組、空白對照組、轉(zhuǎn)染miR-19a抑制組。

1.3脂質(zhì)體介導(dǎo)miR-19a轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞 取對數(shù)生長期LoVo細(xì)胞，根據(jù)Lipofectamine2000說明書按照步驟轉(zhuǎn)染等量的miR-19a模擬物和miR-19a抑制物，100 pmol羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的hsa-miR-19a模擬物或hsa-miR-19a抑制物,分別加入5 μl Lipofectamine2000與250 μl Opti-MEM，混合，室溫下孵育5 min。將稀釋液輕輕搖勻，使其充分混合后室溫下孵育20 min，以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。轉(zhuǎn)染復(fù)合物需加入實驗組的每個孔內(nèi)，然后余下的孔每個都需要補齊無血清DMEM到2 ml，且對照組也加入。轉(zhuǎn)染后6～8 h更換為2%FBS培養(yǎng)基2 ml，置37℃常規(guī)培養(yǎng)待檢測，再等1～2 d后即可檢測〔26〕。

1.4檢測轉(zhuǎn)染后miR-19a基因的表達(dá) 實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：從轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物或抑制物24 h后的LoVo細(xì)胞中提取總RNA，1 μg總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為16℃ 30 min,42℃ 30 min及85℃ 5 min 1 μl RT產(chǎn)物構(gòu)建20 μl PCR體系擴增miR-19a及GAPDH,引物序：miR-19a：正義：5′-GGAGTTCCTGGACCAGTACG-3′，反義：5′-TTCTTGTGCTTGTG CCATGT-3′；GAPDH:正義5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,反義5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。mRNA擴增參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min,95℃ 15 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,擴增40個循環(huán)。miRNA擴增參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,擴增40個循環(huán)。相對表達(dá)量用2-△△Ct表示,其中SOCS3 mRNA的△Ct=Ct(SOCS3 mRNA)-Ct(GAPDH),miR-19a的△Ct=Ct(miR-19a)-Ct(U6),△△Ct = △Ct處理組-△Ct對照組〔17〕。

1.5利用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖能力 將1.3中各組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后每過12 h給予100 μl/孔的CCK8。37℃孵育2 h后用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長下測定各孔吸光度，取各組平均吸光度，每組實驗重復(fù)3次〔17〕。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-19a對細(xì)胞增殖周期、細(xì)胞凋亡的影響 將1.3中各組細(xì)胞2 000 r/min離心5 min，第一次加入PBS洗滌2次，再離心去除PBS，離心后加入1 ml預(yù)冷乙醇，在4℃的溫度下一夜后重復(fù)操作即第二次加入含0.3% Triton和50 μg/ml RNaseA的PBS洗滌細(xì)胞2次，最后37℃孵育30 min離心，再加PBS洗2次后便可收集。將PI染液700 μl加入收集好的細(xì)胞中，在37℃避光條件下染色15 min。取104個細(xì)胞用于測定結(jié)果，取得樣品后軟件分析計算DNA含量得出細(xì)胞周期百分比。

培養(yǎng)好的LoVo細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，5×105個/孔，第2天待其貼壁后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并將24、48 h的LoVo細(xì)胞置于試管中，按上述分組離心10 min(2 000 r/min)后棄掉上清液，用PBS 清洗2遍，在70%～80% 冰乙醇內(nèi)保存，-20℃固定2 h以上，再離心10 min(2 000 r/min)，PBS漂洗后將PI染料150 μl 置于每孔，在室溫避光的條件下孵育30 min，過400目網(wǎng)篩后上機測得結(jié)果〔26〕。

1.7細(xì)胞侵襲小室法檢測細(xì)胞的體外侵襲力 首先構(gòu)建侵襲小室，用5×105個/ml的250 μl細(xì)胞懸液，加入鋪好基質(zhì)膠的Boyden小室的上室，將其置于24孔板中，而下室的每個孔中需加入一定條件下的200 μl培養(yǎng)液即建立好小室模型，隨機分組(按上述要求)。將其置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，等1～2 d取出小室。用工具擦除聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜上表面殘留的細(xì)胞和基質(zhì)凝膠，隨即用70%甲醇浸泡PET 膜的下表面,固定30 min，再取出用未結(jié)合型蘇木素染色10 min。染色后在光鏡下記錄上、下、左、右、中5 個角度下室面的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取均數(shù)〔27〕。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-19a基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物組miR-19a水平(0.80±0.09)較空白對照組(0.44±0.04)明顯升高(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miR-19a抑制物組miR-19a水平為(0.23±0.02)，各組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；并且說明miRNA-19a在結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞呈高表達(dá)，見圖1。

圖1 各組miR-19a基因的表達(dá)

2.2細(xì)胞的增殖能力 轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物組LoVo細(xì)胞的增殖能力(1.58±0.06)較空白對照組(1.06±0.05)明顯升高(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-19a抑制物組LoVo細(xì)胞增殖能力(0.83±0.04)較空白對照組明顯下降(P<0.01)。提示miR-19a與結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)。

2.3細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡 與轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物組和空白對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-19a抑制物組的凋亡率明顯升高，而且G2/M期所占的比例顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡比較

與轉(zhuǎn)染miR-19a抑制物組比較：1)P<0.05

2.4細(xì)胞的體外侵襲力 轉(zhuǎn)染miR-19a模擬物的侵襲能力大于其他兩組。見圖2。

圖2 各組LoVo細(xì)胞的侵襲能力(×200)

3 討 論

文獻(xiàn)指出，腫瘤組織中的miR也存在于癌癥患者的血液循環(huán)中，并且能反映它在組織中的表達(dá)程度，進(jìn)一步說明miR對腫瘤早期診斷、早期預(yù)防及預(yù)后具有重要的作用〔28～30〕。研究顯示，miR在指導(dǎo)癌癥的診斷和治療方面有重要的作用〔31,32〕。研究顯示〔7〕，miR存在于結(jié)腸癌患者血液和結(jié)腸癌組織中，這類獨特小RNA在研究結(jié)腸癌的領(lǐng)域功不可沒。郭運生等〔11〕用軟件Pictar，TargegtScan 預(yù)測miR-19a的靶基因，發(fā)現(xiàn)它能與肝癌缺乏基因(DLC)1的3′UTR 端結(jié)合，并驗證了它與DLC1在促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖方面的作用。miR-19a在其他細(xì)胞中，通過靶定腫瘤壞死因子-α，Cullin5，正次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)1和氨肽酶樣蛋白1抗體(NPEPL1)等靶基因調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為〔33～35〕。本文結(jié)果認(rèn)為miR-19a在結(jié)腸癌中有致癌基因的功能?，F(xiàn)有研究表明，miR-19a 還可以對非小細(xì)胞肺癌起作用，原理就是通過調(diào)控組織因子表達(dá)和減少PC9細(xì)胞的體外增殖〔36,37〕。miR-19a對血液系統(tǒng)相關(guān)疾病的診斷也有一定作用〔38〕。而對于結(jié)腸癌患者，miR-19a致癌基因的作用應(yīng)該是通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖活性，即上調(diào)miR-19a的表達(dá)，細(xì)胞體外增殖能力增強，細(xì)胞周期S期細(xì)胞數(shù)增多，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞的侵襲力增強；下調(diào)miRNA-19a的表達(dá)，細(xì)胞體外增殖能力降低，細(xì)胞周期S期細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞的侵襲力降低。