張黎靜 黃崢嶸 孫文超

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建 廈門 361000)

缺血再灌注(I/R)損傷是一種在心肌組織缺血后，重新恢復(fù)血流供應(yīng)時(shí)，細(xì)胞代謝的功能障礙及結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步惡化的現(xiàn)象，是臨床上在心臟手術(shù)后，引起心肌損傷的重要原因〔1〕。缺血性心臟病是臨床上常見(jiàn)的心肌I/R引起的心臟損傷。細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要過(guò)程，但其過(guò)度活躍則會(huì)導(dǎo)致I/R組織損傷〔2〕。微小RNA(miRNA)是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)器，參與多種疾病的病理生理過(guò)程，而其在心血管疾病中的作用也備受關(guān)注和重視。miR-92a是miRNAs中的一員，在宮頸癌、白血病和肝癌等多種腫瘤疾病中表達(dá)上調(diào)，在腫瘤細(xì)胞增殖凋亡等生理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔3～5〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a在心血管疾病中發(fā)揮重要作用，抑制其表達(dá)可提高再內(nèi)皮化和防止血管損傷后新生內(nèi)膜形成〔6〕。本研究通過(guò)觀察miR-92a在I/R后大鼠模型心肌組織中的表達(dá)，探討其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)SD大鼠20只，鼠齡6～8 w，雄性，體重200～300 g，出生1～3 d的新生SD乳鼠10只，購(gòu)于上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2試劑和儀器 miR-92a抑制劑(miR-92a inhibitor)和miR-92a 陰性對(duì)照(miR-92a NC)購(gòu)于上海吉瑪制藥有限公司。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶和Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、Trizol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒、RNA提取試劑盒和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于大連Takara公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒和膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(FITC-Annexin V/PI)凋亡試劑盒購(gòu)于南京凱基公司；淋巴瘤/白血病(Bcl)-2單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3多克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠或抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗均購(gòu)于美國(guó)Santa cruz公司。動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司，CO2培養(yǎng)箱、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，PCR儀、電泳儀和流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3方法

1.3.1I/R損傷模型的制備 將SD大鼠以每組10只隨機(jī)分為I/R組和假手術(shù)組，所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，固定，行氣管插管，接通呼吸機(jī)機(jī)械通氣。對(duì)I/R組大鼠結(jié)扎冠狀動(dòng)脈30 min后松開(kāi)建立心肌缺血大鼠模型，在恢復(fù)供血后再灌注2 h。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用心電圖進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在結(jié)扎后，出現(xiàn)心電圖ST段抬高、T波高聳等表現(xiàn)，而松開(kāi)動(dòng)脈夾開(kāi)放供血后，出現(xiàn)抬高的ST段開(kāi)始降低、T波慢慢恢復(fù)的現(xiàn)象，則表示I/R建模成功。

1.3.2心肌細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧/復(fù)氧(H/R)模型建立 取新生SD乳鼠，以酒精消毒后，在無(wú)菌環(huán)境下處死取其心臟。以無(wú)菌眼科剪將其制成組織碎塊，加入胰蛋白酶于冰上預(yù)處理30 min后，攪拌器攪拌，取上清液；再向組織碎塊中加胰蛋白酶，預(yù)處理，攪拌，取上清液，重復(fù)3次后，將所有上清液合并離心。棄上清后加入DMEM培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞后接種于培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)，取上清液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于6孔細(xì)胞板上，其中培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。加入濃度0.1 mmol/L 5-溴脫氧核苷，培養(yǎng)72 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為常氧組和H/R組。其中，H/R組細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清處理12 h后，在1%O2-94%N2-5%CO237℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，再轉(zhuǎn)至95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。常氧組細(xì)胞則一直在95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3miR-92a檢測(cè) 分別取新鮮的心肌組織和心肌細(xì)胞，加入Trizol提取細(xì)胞總RNA，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定所提到的總RNA的濃度及純度，以RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將心肌組織或細(xì)胞的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，加入引物0.2 μl及相應(yīng)組分制成10 μl的反應(yīng)體系，按照95℃預(yù)變性180 s(1個(gè)循環(huán))、95℃變性10 s(35個(gè)循環(huán))、60℃退火20 s(35個(gè)循環(huán))、72℃延伸10 s(35個(gè)循環(huán))和72℃總延伸300 s(1個(gè)循環(huán))的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-92a在心肌組織和細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將制備的原代心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為6×106個(gè)/ml后接種于96孔細(xì)胞板上，置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。將其隨機(jī)分為對(duì)照組，miR-92a NC組和miR-92a inhibitor組。以Lipofectamine2000將miR-92a 抑制劑和miR-92a 陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至miR-92a inhibitor組和miR-92a NC組細(xì)胞中，空白對(duì)照組細(xì)胞不做轉(zhuǎn)染，其中miR-92a 抑制劑和miR-92a 陰性對(duì)照的濃度為20 nmol/L。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以1.3.3中的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效果。

將制備的原代心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后接種于96孔細(xì)胞板上，置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將其隨機(jī)分為對(duì)照組、I/R組和I/R+miR-92a inhibitor組。將I/R組和miR-92a inhibitor+I/R組細(xì)胞在經(jīng)無(wú)血清處理12 h后，在條件為1%O2-94%N2-5%CO237℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)陪養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)至95%空氣-5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。其中miR-92a inhibitor+I/R組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，以Lipofectamine2000將miR-92a抑制劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染4 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.5細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集上述對(duì)照組、I/R組和I/R+miR-92a inhibitor組細(xì)胞，以胰蛋白酶消化后，加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。向含有105個(gè)細(xì)胞的100 μl細(xì)胞懸液中加入Annexin V-FITC 5 μl染色10 min后，再加入PI 10 μl染色，補(bǔ)加結(jié)合緩沖液500 μl，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.3.6凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè) 收集對(duì)照組、I/R組和I/R+miR-92a inhibitor組細(xì)胞，以RIPA裂解液裂解各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)提取各組總蛋白的濃度。將蛋白置于沸水浴中變性后，取50 μg蛋白樣品，于5%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)行分離。電轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜上，經(jīng)封閉液4 ℃下封閉3 h后，加入Bcl-2(1∶1 000)、酶切Caspase-3(1∶1 000稀釋的)和GAPDH(1∶1 000)抗體，于4 ℃過(guò)夜，再以二抗(1∶2 000)室溫反應(yīng)2 h，ECL試劑盒發(fā)光顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，分析Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-92a在缺血再灌注心肌組織中的表達(dá) 與假手術(shù)組(1.02±0.03)相比，I/R組心肌組織中miR-92a的相對(duì)表達(dá)水平(2.35±0.16)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2miR-92a在缺血再灌注后心肌細(xì)胞中表達(dá)及轉(zhuǎn)染效果 H/R組心肌細(xì)胞中miR-92a的相對(duì)表達(dá)水平(3.12±0.25)較常氧組(0.96±0.08)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后對(duì)照組、miR-92a NC組和miR-92a inhibitor組心肌細(xì)胞中miR-92a的相對(duì)表達(dá)水平分別為(1.10±0.05)、(0.96±0.06)和(0.23±0.06)。與對(duì)照組相比，miR-92a NC組細(xì)胞中miR-92a的相對(duì)表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，miR-92a inhibitor組細(xì)胞中miR-92a的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3miR-92a對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組(6.38±0.52)%相比，I/R組細(xì)胞凋亡率(21.35±1.06)%顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I/R+miR-92a inhibitor組細(xì)胞凋亡率(15.28±2.15)%較I/R組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4miR-92a對(duì)Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，I/R組細(xì)胞中Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，酶切Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+miR-92a inhibitor組細(xì)胞中Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，酶切Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)

組別Bcl-2酶切Caspase-3對(duì)照組0.92±0.050.14±0.03I/R組0.25±0.031)0.55±0.081)I/R+miR-92a inhibitor組0.68±0.062)0.23±0.042)F/P值148.157/0.00046.955/0.000

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05

3 討 論

MiR-92a基因家族是癌基因miR-17-92基因簇中的重要成員，它包括結(jié)構(gòu)相似、序列相似和種子區(qū)序列相同的miR-25、 miR-363、miR-92a～1和miR-92a～2 的4個(gè)成員，是一類高度保守的與血管內(nèi)皮細(xì)胞形成密切相關(guān)的miRNA；成熟的MiR-92a基因是由miR-92a～1和miR-92a～2基因生成〔9，10〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a在胃癌和結(jié)直腸癌等組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)〔11，12〕。miR-92a還參與多種疾病細(xì)胞增殖凋亡的生理病理過(guò)程。Iaconetti等〔13〕通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制miR-92a表達(dá)能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。Niu等〔14〕發(fā)現(xiàn)，miR-92a反義寡核苷酸通過(guò)逆表達(dá)BCL2L11誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。Murata等〔15〕研究指出，通過(guò)抑制miR-92a能夠促進(jìn)血管再生增強(qiáng)骨折愈合能力，在組織修復(fù)方面具有重要作用。本研究結(jié)果提示，下調(diào)miR-92表達(dá)可抑制I/R引起的細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到減輕心肌缺血再灌注損傷的作用。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的程序性死亡過(guò)程，心肌細(xì)胞凋亡與心肌缺血再灌注損傷程度密切相關(guān)，抑制心肌細(xì)胞凋亡是改善心肌缺血再灌注損傷的有效途徑。細(xì)胞凋亡是十分復(fù)雜而又嚴(yán)密的過(guò)程，受到多種基因和蛋白的多途徑調(diào)控。Bcl-2是公認(rèn)的抗細(xì)胞凋亡基因，是細(xì)胞凋亡線粒體途徑的重要調(diào)控因子；Caspase-3是公認(rèn)的細(xì)胞凋亡過(guò)程的執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的核心調(diào)控作用〔16，17〕。Bcl-2和Caspase-3均是反應(yīng)細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)，缺血-再灌注后使心肌細(xì)胞受到刺激產(chǎn)生大量的自由基，引起細(xì)胞膜和線粒體等損傷，通過(guò)不同途徑激活或調(diào)控Caspase-3和Bcl-2基因，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，與心肌細(xì)胞的凋亡過(guò)程密切相關(guān)。姚紅玲等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血/再灌注組大鼠肺組織中Caspase-3表達(dá)顯著升高和Bcl-2表達(dá)顯著減少。牛巍巍等〔19〕發(fā)現(xiàn)，miR-92a可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。Lan等〔20〕研究指出，過(guò)表達(dá)miR-92a能夠通過(guò)MKK4-JNK1途徑和酶切Caspase-3蛋白的表達(dá)抑制H2O2誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示，miR-92a可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白和下調(diào)酶切Caspase-3蛋白的表達(dá)，發(fā)揮了抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上，miR-92a在缺血再灌注后心肌組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，下調(diào)miR-92a表達(dá)后能夠減弱缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)控Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白的表達(dá)有關(guān)。以miR-92a為靶點(diǎn)預(yù)防和減輕缺血/再灌注損傷等心血管疾病的研究提供新的方向和參考依據(jù)。